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Biology

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/64098
, , , , , , , , ,
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering,University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Florida, 3Department of Biostatistics,University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE),University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center,University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences,University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine,University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering,University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics,University of Florida

Summary

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Abstract

Eine grundlegende Frage in der Mechanobiologie ist, wie lebende Zellen extrazelluläre mechanische Reize im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie wahrnehmen. Es wird angenommen, dass die zelluläre Mechano-Empfindung extrazellulärer mechanischer Reize durch die Membranrezeptoren, den zugehörigen Proteinkomplex und das Zytoskelett erfolgt. Jüngste Fortschritte in der Mechanobiologie zeigen, dass der Zellkern im Zytoplasma selbst selbstständig mechanische Reize gleichzeitig wahrnehmen kann. Ein mechanistisches Verständnis darüber, wie der Zellkern mechanische Reize wahrnimmt, umleitet und darauf reagiert, fehlt jedoch, hauptsächlich aufgrund der technischen Herausforderungen beim Zugriff auf und der Quantifizierung der Kernmechanik mit herkömmlichen Werkzeugen. Dieses Papier beschreibt das Design, die Herstellung und die Implementierung eines neuen magnetischen Kraftaktors, der präzise und nicht-invasive mechanische 3D-Reize anwendet, um den Zellkern direkt zu verformen. Unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Zellen zeigt diese Studie, dass dieses Werkzeug in Kombination mit hochauflösender konfokaler fluoreszierender Bildgebung die Aufdeckung der Echtzeitdynamik eines mechanosensitiven yes-assoziierten Proteins (YAP) in einzelnen Zellen als Funktion der Kernverformung ermöglicht. Diese einfache Methode hat das Potenzial, die derzeitige Technologielücke in der Mechanobiologie zu schließen und Antworten auf die Wissenslücke zu geben, die in der Beziehung zwischen Kernmechanotransduktion und Zellfunktion besteht.

Introduction

Diese Studie zielt darauf ab, eine neue Technik zur Aufklärung der Kernmechanobiologie zu entwickeln und anzuwenden, indem die magnetischen Aktoren, die mechanische Kraft direkt auf den Zellkern ausüben, und die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die gleichzeitig die strukturellen und funktionellen subzellulären Veränderungen abbildet, kombiniert werden. Zellen erfassen extrazelluläre biophysikalische Signale einschließlich Gewebesteifigkeit 1,2,3,4, interstitiellen Flüssigkeitsdruck und Scherspannung 5,6,7, Oberflächentopologie/-geometrie 8,9,10,11,12 und Zug-/Druckspannung13,14, 15,16. Biophysikalische Signale werden in biochemische Signale umgewandelt und lösen mögliche nachgeschaltete Veränderungen der Genexpression und des Zellverhaltens aus – ein Prozess, der als Mechanotransduktion bekannt ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um Mechanotransduktionsprozesse zu untersuchen, wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um mechanische Kraft auf die Zellen auszuüben, wie Rasterkraftmikroskopie28, Zelldehnungsgerät29, Bio-MEMS (mikroelektromechanische Systeme) Kraftsensor 15,30,31, Scherrheologie 32 und Stereo Vision System 33 . Eine kürzlich durchgeführte Übersicht fasst die Ansätze zur Anwendung extrazellulärer mechanischer Hinweise und zur Störung der Mechanosensorik zusammen34. Bisher üben die meisten dieser Methoden Kraft auf die Zellplasmamembran aus, und Zellen empfangen diese extrazellulären biophysikalischen Signale direkt über Membranrezeptoren wie Integrin, Cadherin, Ionenkanäle und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Anschließend leiten sie das Signal an das intrazelluläre Zytoskelett und den Zellkern weiter. Zum Beispiel wird gezeigt, dass Zellen unter Verwendung der YAP-Translokation (Yes-assoziiertes Protein) als Indikator für die Mechano-Sensorik die mechanischen Signale der Substratsteifigkeit und extrazellulären Spannung von der Zellmembran wahrnehmen und durch das Zytoskelett in den Zellkern übertragen, um eine YAP-Zytoplasma-zu-Zellkern-Translokation zu induzieren28,35.

Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Zellkern selbst ein unabhängiger Mechanosensorist 8,36,37. Dies wird durch Experimente bewiesen, die an dem isolierten Kern aus Zellen durchgeführt wurden, wo gezeigt wurde, dass Kerne ihre Steifigkeit adaptiv als Reaktion auf die mechanische Kraft ändern, die direkt auf sie ausgeübt wird36. Unter vielen physiologischen Bedingungen nehmen Kerne sowohl in Tumor- als auch in gesunden Zellen extrazelluläre biophysikalische Signale wahr und verändern ihre mechanischen Eigenschaften und Anordnungen38,39,40. Zum Beispiel nimmt bei Extravasation die Kernsteifigkeit von Tumorzellen ab und hält die Weichheit für mehr als 24 h38 aufrecht. Während der Migration durch den begrenzten interstitiellen Raum verlieren die Kerne von Tumorzellen häufig ihre strukturelle Integrität und gewinnen sie wieder39. Die Art und Weise, wie der Zellkern das biophysikalische Signal wahrnimmt, ist jedoch unbekannt, obwohl mehrere Kernhüllproteine und Proteinfamilien beteiligt sind, wie Lamin A / C und Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) -Komplex38,41. Neue nicht-invasive Methoden, die direkt Kraft auf den Zellkern ausüben können, werden daher die Wirkung der Kraftübertragung von der Zell-Plasma-Membran und dem Zytoskelett entkoppeln und dazu beitragen, die bisher unzugänglichen molekularen Mechanismen der nuklearen Mechano-Sensorik aufzuklären.

Forschungen, die optische Pinzetten zur Manipulation von Organellen42 und Mikroperlen, die in Zellen43 injiziert wurden, verwendeten, zeigten die technologische Fähigkeit, direkt Kraft auf den Kern auszuüben. Die optische Pinzettentechnik hat jedoch mehrere Einschränkungen: (1) optische Pinzetten mit niedrigem Durchsatz manipulieren oft nur eine Zelle oder Mikroperle gleichzeitig; und (2) potentielle Photoschäden und Temperaturartefakt-Verformungen von Kernkern erfordern Dutzende von pN36, und die entsprechende notwendige Laserleistung beträgt etwa 10 mW pro pN44,45. Eine solche Laserintensität ist ausreichend, um Photoschäden in den Zellen auszulösen und die Zellfunktionen während des Experiments46 zu stören.

Die magnetische Kraft, die durch Mikroperlen in lebenden Zellen ausgeübt wird, zeigt das Potenzial, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und überwindet die Einschränkungen optischer Pinzetten. Sobald Mikroperlen in das Zytoplasma abgegeben werden, kann ein Magnetfeld eine magnetische Kraft auf mehrere Mikrokügelchen gleichzeitig und mit hohem Durchsatz ausüben. Das Magnetfeld beeinflusst nicht die Zellfunktionen47, sondern erzeugt Kraft von pN nach nN, was ausreicht, um eine Kernverformung 36,48,49 zu induzieren. Bisher wurde die Manipulation magnetischer Mikroperlen an der Zellplasmamembran48, im Zytoplasma50, an F-Aktin51, im Kern47 und am isolierten Kern36 angewendet. Die magnetische Manipulation von Mikroperlen wurde jedoch nie verwendet, um direkte mechanische Kraft auf die Kernhülle auszuüben, um die Mechanotransduktion im Kern zu untersuchen.

In dieser Arbeit wird eine einfache Technik entwickelt, um nicht-invasiv magnetische Mikroperlen in das Zytoplasma zu transportieren und diese Mikroperlen zu verwenden, um mechanische Kraft auf den Kern auszuüben (Abbildung 1). Hier werden CRISPR/Cas9-entwickelte humane normale B2B-Zelllinien, die endogen mNeonGreen21-10/11-markiertes YAP exprimieren, verwendet, um die Methode zu validieren. YAP ist ein mechanosensitives Protein, und die Translokation von YAP wird durch nukleare mechano-sensingreguliert 14,28. Der CRISPR/Cas9-regulierte Knock-in-Ansatz wurde gewählt, um endogenes YAP mit einem fluoreszierenden Protein (FP) mNeonGreen21-10/11 zu markieren. Obwohl bekannt ist, dass die CRISPR-Bearbeitung eine unvollständige Effizienz und einen Off-Target-Effekt hat, integrierten die Protokolle in früheren Publikationen eine Fluoreszenzsortierung, um die korrekte Einfügung des offenen Leserahmens52,53,54 auszuwählen. Mit dieser zusätzlichen Selektionsschicht wurde in 20+ Zelllinien, die zuvor52,53,54,55 erzeugt wurden, kein Off-Target-Tagging-Ereignis beobachtet. Dies ist ein Split-Fluoreszenzprotein-Konstrukt, aber im Prinzip könnte jede ausdrückbare fluoreszierende Markierung verwendbar sein. Dieser Markierungsansatz ist Transgen- oder Antikörpermethoden überlegen. Erstens behält das markierte Protein im Gegensatz zur Transgenexpression die Einzelkopie-Gendosierung bei und exprimiert im physiologischen Kontext des nativen genregulatorischen Netzwerks, wodurch Abweichungen in Proteinkonzentration, Lokalisation und Interaktion begrenzt werden. Die in dieser Studie verwendete Tagging-Methode erreicht über eine Größenordnung einen höheren Durchsatz und eine höhere Effizienz als das vollständige FP-Tagging. Es vermeidet auch Herausforderungen im Zusammenhang mit Immunfluoreszenz aufgrund von Fixierungsartefakten und der begrenzten Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Antikörpern mit hoher Spezifität. Zweitens führt der in dieser Arbeit verwendete Ansatz eine minimale Störung der Zellphysiologie durch und ermöglicht die authentische Offenbarung aller endogenen YAPs in Echtzeit. Im Gegensatz dazu führen andere gängige Transgenmethoden oft zu einer Überexpression von YAP. Die daraus resultierende künstliche Verteilung kann möglicherweise Zytotoxizität verursachen und die mechano-sensing von Zellenbeeinflussen 56,57,58.

Diese Studie stellt ein Protokoll vor, um durch magnetische Mikroperlen, die in das Zytoplasma abgegeben werden, direkt Kraft auf den Kern auszuüben und gleichzeitig eine Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Protokolle, wie man (1) magnetische Mikroperlen in die Zelle außerhalb des Kerns liefert, (2) die Mikroperlen manipuliert, um magnetische Kraft auf den Kern auszuüben, (3) konfokale fluoreszierende Bildgebung der Zellen während der Manipulation durchführt und (4) das YAP-Kern- / Zytoplasma-Verhältnis (N / C) während des gesamten Kraftanwendungsprozesses quantitativ analysiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) durch Endozytose magnetische Mikrokügelchen innerhalb von 7 h nicht-invasiv in das Zytoplasma von B2B-Zellen abgegeben werden können (Abbildung 2 und Abbildung 3); und (2) quantifizierte magnetische Kraft, die direkt auf den Kern ausgeübt wird (Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6), kann allein verschiedene Änderungen des YAP N / C-Verhältnisses in CRISPR / Cas9-B-Zellen auslösen (Abbildung 7 und Abbildung 8).

Protocol

1. Wartung von CRISPR/Cas9-entwickelten B2B-Zellen Kultur von B2B-Zellen in einem T25-Kolben mit RPMI-1640, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin. Die B2B-Zellen werden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 gehalten. Subkultur der B2B-Zellen, wenn der Konfluenz 70% bis 80% erreicht. Lagern Sie die B2B-Zelllinie in RPMI-1640 Kulturmedium mit 10% (v/v) DMSO in einem -80 °C Gefrierschrank. Verwenden Si…

Representative Results

Entwurf einer magnetbeweglichen Vorrichtung und Anwendung der MagnetkraftUm Kraft auf den Kern durch die magnetischen Mikroperlen auszuüben, wurde eine magnetbewegliche Vorrichtung entworfen und gebaut, um die räumliche Position des Magneten zu steuern. Die magnetbewegliche Vorrichtung enthält einen zentralen Rahmen, drei Drehknöpfe und Schienen, um den angebrachten Magneten unabhängig voneinander in x-, y- und z-Richtung mit der räumlichen Auflösung von 1,59 mm pro Zyklus zu bewegen (<strong …

Discussion

Die Internalisierung magnetischer Mikroperlen (Abschnitt 2.2) ist von entscheidender Bedeutung, da extrazelluläre Mikroperlen keine Kraft direkt auf den Kern ausüben können. Krafteinleitung und Bildgebung (Abschnitt 5.3) sind kritische Schritte in diesem Experiment, und die Kraft, die benötigt wird, um den Kern zu verformen und sinnvolle biologische Konsequenzen zu induzieren, könnte probenabhängig sein. Die Kraftstärke in diesem Experiment (0,8 nN und 1,4 nN) kann weiter erhöht werden, um die nukleare Mechano-Se…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wird durch das UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), den UFHCC Pilot Award (X. T. und Dr. Dietmar Siemann), den UF Opportunity Seed Fund (X. T.) und das UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang) finanziert. Wir schätzen die intellektuellen Gespräche und die fachliche Unterstützung durch Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (University of Arizona), und Support-Team von Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon und Jon Ekman). Wir sind zutiefst dankbar für die effektive Unterstützung durch alle Mitglieder der Forschungslabors von Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann und Guan sowie alle Mitarbeiter der UF MAE-Abteilung.

Materials

0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).
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