Histologische Grundlagen und Zelltodnachweis in Honigbienengewebe
Summary
Immunhistochemische Methoden sind in der Honigbienenforschung nützlich, um den Grad der Apoptose und Nekrose in den Mitteldarm- und Hypopharynxdrüsen erwachsener Bienen zu erkennen und zu beurteilen.
Abstract
Honigbienen (Apis mellifera L.) innerhalb des Bienenstocks (Ammenarbeiter und andere Bienenstöcke) und außerhalb des Bienenstocks (Sammler) sind Klima- und Wetteränderungen, verschiedenen Pestiziden, Krankheitserregern und Unterernährung ausgesetzt, die hauptsächlich durch den Mund gelangen und hauptsächlich den Verdauungstrakt erwachsener Bienen betreffen. Um die Auswirkungen solcher externen und inneren Stressoren auf Honigbienen zu verstehen und zu verhindern, ist eine nützliche Forschungsmethode die immunhistochemische Methode. Es wird ein grundlegendes Protokoll beschrieben, um den Mitteldarm (Ventriculus) und die hypopharyngealen Drüsen (HPGs) erwachsener Bienen für die histologische Analyse vorzubereiten. Eine detaillierte Methodik wird beschrieben, um den Grad der Zellschädigung zu beurteilen und die Nekrose vom programmierten Zelltod (Apoptose) als natürlichen Prozess der Geweberegeneration zu unterscheiden. Die Ergebnisse der adulten Honigbienenbehandlung mit Oxalsäure und Pestiziden (Insektizid und Akarizid) und die Bestimmung des Zelltods im Ventriculus und HPGs werden vorgestellt. Die Vor- und Nachteile der Methodik werden ebenfalls diskutiert.
Introduction
Honigbienen (Apis mellifera L.) sind neben anderen Wildbestäubern die wichtigsten Bestäuber landwirtschaftlicher Pflanzen. Über Tausende von Jahren hat die sich verändernde Umwelt Bienen beeinflusst, ihre Morphologie, Physiologie, ihr Verhalten und ihre Toleranz an verschiedene Krankheitserreger und Parasiten anzupassen. Daher haben Honigbienen rund um den Globus ein sehr vielfältiges Arten- und Unterartenspektrum entwickelt1. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Befunden überein, dass es genetische Variationen in der Verdauungstraktstruktur der Honigbiene gibt, deuten aber auch darauf hin, dass Veränderungen des Mitteldarms auf Umweltfaktoren zurückzuführen sind 2,3.
Der Verdauungstrakt der Honigbiene besteht aus drei Hauptteilen: Vorderdarm, Mitteldarm (Ventriculus) und Hinterdarm4. Der Ventriculus ist ein essentielles Organ für die Verdauung von Pollen und Nektar/Honig; Im Hinterdarm erfolgt die osmotische Kontrolle durch Aufnahme von Wasser und Ionen2. Die hypopharyngealen Drüsen (HPGs) von Honigbienenarbeitern befinden sich im Kopf und synthetisieren und sezernieren Gelée Royale-Komponenten, um die Brut, die Königin und Mitglieder der Kolonie zu füttern. Ihre Größe ändert sich mit Alter und Aufgaben und hängt von der richtigen Ernährung (Qualitätspollen) ab. Krankenschwestern im Alter von 6 bis 18 Tagen führen Brutaufzucht durch, und die Größe der HPGs nimmtum 5,6 zu. Bei Sammelbienen degenerieren die HPGs und sezernieren nur Enzyme, die wichtig sind, um die komplexen Zucker in einfache umzuwandeln (α-Glucosidasen, Leucin-Arylamidase, Invertase) in Honig7.
Honigbienen sind mehreren biotischen und abiotischen Stressoren ausgesetzt8, und der Verdauungstrakt kann durch mehrere negative Stimulanzien beeinträchtigt werden. Die erste Barriere, die den Organismus vor Krankheitserregern schützt, ist die peritrophe Membran im Mitteldarm, die zum Schutz vor Krankheitserregern aus Darmschleimhaut besteht4. Die Entwicklung und Funktion von HPGs hängen von Ernährung, Alter und Koloniezustandab 9 und werden durch Insektizide, Akarizide 10 und Krankheitserreger11,12,13 beeinflusst. Akarizidrückstände im Bienenstock aufgrund der Varroabekämpfung und Pestizide aus der Umwelt beeinträchtigen Sammlerbienen und Ammenbienen14,15. Die größte Bedrohung für Honigbienenvölker ist die Milbe Varroa destructor, sowohl als Vektor von Viren, die zu Völkerverlusten beitragen16 als auch als Konsument des Fettkörpers des Wirts (ein wichtiges lebenswichtiges Organ bei Honigbienen), der folglich den Körper und die Koloniefunktionen des Individuums beeinträchtigt17.
Intensive landwirtschaftliche Lebensräume können jedoch eine kurzfristige Nahrungsversorgung für Honigbienen darstellen. Daher sollten Agrarumweltmaßnahmen die Verfügbarkeit von Honigblumen in Agrarlandschaften verbessern18. Um die Morphologie verschiedener Unterarten 6,19,20,21 oder subletale Effekte dieser Faktoren auf Zell- oder Gewebeebene, insbesondere Mitteldarm und HPGs, zu beurteilen, sind histologische und immunhistochemische Methoden praktisch und ausreichend genau, um in der histologischen Forschung an Honigbienen eingesetzt zu werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In lebenden Organismen wird der Zelltod als Apoptose oder Nekrose25 definiert und kann von Autophagie26 begleitet werden. Der Unterschied zwischen apoptotischen und nekrotischen Zellen besteht darin, dass Apoptose eine Form des programmierten Zelltods ist und in normalen Zellen auftritt, während Nekrose aufgrund tödlicher Bedingungen (z. B. Unfall, Krankheit) auftritt27,28. Apoptose kann mit Assay-Kits nachgewiese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich bedanke mich für die Unterstützung der slowenischen Forschungsagentur, Zuschuss Nr. P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
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