Bal Arısı Dokusunda Histolojinin Temelleri ve Hücre Ölümü Tespiti
Summary
İmmünohistokimyasal yöntemler, yetişkin arıların midgut ve hipofaringeal bezlerindeki apoptoz ve nekroz seviyesini tespit etmek ve değerlendirmek için bal arısı araştırmalarında yararlıdır.
Abstract
Kovanın içindeki (hemşire işçiler ve diğer kovan arıları) ve kovanın dışındaki bal arıları (Apis mellifera L.) (toplayıcılar), iklim ve hava değişikliklerine, çeşitli pestisitlere, patojenlere ve yetersiz beslenmeye maruz kalmaktadır, esas olarak ağızdan girmekte ve öncelikle yetişkin arıların sindirim yollarını etkilemektedir. Bu tür dış ve iç stresörlerin bal arıları üzerindeki etkilerini anlamak ve önlemek için, yararlı bir araştırma yöntemi immünohistokimyasal yöntemdir. Histolojik analiz için yetişkin arıların midgut (ventrikül) ve hipofaringeal bezlerini (HPG’ler) hazırlamak için temel bir protokol tanımlanmıştır. Hücre hasarının seviyesini değerlendirmek ve nekrozu doğal bir doku rejenerasyonu süreci olarak programlanmış hücre ölümünden (apoptoz) ayırt etmek için ayrıntılı bir metodoloji açıklanmaktadır. Oksalik asit ve pestisitler (insektisit ve akarisit) ile erişkin bal arısı tedavisinin sonuçları ve ventriküls ve HPG’lerde hücre ölümünün belirlenmesi sunulmaktadır. Metodolojinin artıları ve eksileri de tartışılmaktadır.
Introduction
Bal arıları (Apis mellifera L.), diğer vahşi tozlayıcıların yanı sıra, tarımsal bitkilerin en önemli tozlayıcılarıdır. Binlerce yıl boyunca, değişen çevre arıların morfolojilerini, fizyolojilerini, davranışlarını ve toleranslarını çeşitli patojenlere ve parazitlere uyarlamalarını etkilemiştir. Bu nedenle, bal arıları dünya çapında çok çeşitli türler ve alt türler geliştirmiştir1. Bu sonuçlar, bal arısının sindirim sistemi yapısında genetik çeşitlilik olduğu yönündeki önceki bulgularla tutarlıdır, ancak aynı zamanda midgut değişikliklerinin çevresel faktörlerden kaynaklandığını düşündürmektedir 2,3.
Bal arısının sindirim sistemi üç ana bölüme sahiptir: foregut, midgut (ventriculus) ve hindgut4. Ventrikül, polen ve nektar/balın sindirimi için gerekli bir organdır; hindgutta, ozmotik kontrol suyun ve iyonların emilimi yoluyla gerçekleşir2. Bal arısı işçilerinin hipofaringeal bezleri (HPG’ler) kafada bulunur ve yavruyu, kraliçeyi ve koloninin üyelerini beslemek için arı sütü bileşenlerini sentezler ve salgılar. Büyüklükleri yaş ve görevlerle birlikte değişir ve doğru beslenmeye (kaliteli polen) bağlıdır. 6 ila 18 günlük hemşire işçiler yavru yetiştiriciliği gerçekleştirir ve HPG’lerin boyutu 5,6 artar. Toplayıcı arılarda, HPG’ler dejenere olur ve sadece karmaşık şekerleri balda basit olanlara (α-glukozidazlar, lösin arylamidaz, invertaz) dönüştürmek için önemli olan enzimleri salgılar7.
Bal arıları çeşitli biyotik ve abiyotik stresörlere maruz kalır8 ve sindirim sistemi birkaç olumsuz uyarıcıdan etkilenebilir. Organizmayı patojenlerden koruyan ilk bariyer, patojenlere karşı korunmak için bağırsak mukozasından oluşan midguttaki peritrofik zardır4. HPG’lerin gelişimi ve işlevi diyete, yaşa ve koloni durumuna bağlıdır9 ve insektisitler, akarisitler10 ve patojenler 11,12,13’ten etkilenir. Varroa kontrol tedavisine bağlı kovanda bulunan akarisit kalıntıları ve çevreden gelen pestisitler toplayıcı arıları ve hemşire arıları etkilemektedir14,15. Bal arısı kolonileri için en büyük tehdit, hem koloni kayıplarına katkıda bulunan virüslerin bir vektörü olarak16 hem de konakçının yağ vücudunun (bal arılarında önemli bir hayati organ) tüketicisi olarak akar Varroa yıkıcısıdır, bu da sonuçta bireyin vücudunu ve koloni işlevlerini etkiler17.
Bununla birlikte, yoğun tarım arazisi habitatları, bal arıları için kısa vadeli bir gıda kaynağı sağlayabilir. Bu nedenle, tarım-çevre planları, bal çiçeklerinin tarımsal arazilerde kullanılabilirliğini arttırmalıdır18. Farklı alt türlerin morfolojisini değerlendirmek için 6,19,20,21 veya bu faktörlerin hücre veya doku seviyelerinde, özellikle midgut ve HPG’lerde subletal etkilerini, histolojik ve immünohistokimyasal yöntemler bal arılarında histoloji araştırmalarında kullanılmak üzere pratik ve yeterince doğrudur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı organizmalarda, hücre ölümü apoptoz veya nekroz25 olarak tanımlanır ve otofaji26 eşlik edebilir. Apoptotik ve nekrotik hücreler arasındaki fark, apoptozun programlanmış hücre ölümünün bir şekli olması ve normal hücrelerde ortaya çıkması, nekrozun ise ölümcül koşullar (örneğin, kaza, hastalık) nedeniyle ortaya çıkmasıdır27,28. Apoptoz, TUNEL tekniğine dayanan tahlil kitleri ku…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Slovenya Araştırma Ajansı’nın P4-133 no’lu hibe desteğine minnetle teşekkür ediyorum.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
