Noções Básicas de Histologia e Detecção de Morte Celular em Tecido de Abelhas Melíferas
Summary
Métodos imuno-histoquímicos são úteis na pesquisa de abelhas para detectar e avaliar o nível de apoptose e necrose no intestino médio e nas glândulas hipofaríngeas de abelhas adultas.
Abstract
As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) dentro da colmeia (enfermeiras e outras abelhas da colmeia) e fora da colmeia (forrageiras) estão expostas a mudanças climáticas e climáticas, vários pesticidas, patógenos e desnutrição, entrando principalmente pela boca e afetando principalmente os tratos digestivos das abelhas adultas. Para entender e prevenir os efeitos de tais estressores externos e internos nas abelhas, um método de pesquisa útil é o método imuno-histoquímico. Um protocolo básico é descrito para preparar o intestino médio (ventrículo) e as glândulas hipofaríngeas (HPGs) de abelhas adultas para análise histológica. Uma metodologia detalhada é descrita para avaliar o nível de dano celular e distinguir necrose de morte celular programada (apoptose) como um processo natural de regeneração tecidual. Os resultados do tratamento de abelhas adultas com ácido oxálico e pesticidas (inseticida e acaricida) e a determinação da morte celular no ventrículo e HPGs são apresentados. Os prós e contras da metodologia também são discutidos.
Introduction
As abelhas melíferas (Apis mellifera L.) são, entre outros polinizadores silvestres, os mais importantes polinizadores das plantas agrícolas. Ao longo de milhares de anos, o ambiente em mudança influenciou as abelhas a adaptar sua morfologia, fisiologia, comportamento e tolerância a vários patógenos e parasitas. Portanto, as abelhas desenvolveram uma gama altamente diversificada de espécies e subespécies em todo o mundo1. Esses resultados são consistentes com achados anteriores, de que há variação genética na estrutura do trato digestivo da abelha, mas também sugerem que as alterações do intestino médio são devidas a fatores ambientais 2,3.
O trato digestivo da abelha tem três partes principais: intestino anterior, intestino médio (ventrículo) e intestino posterior4. O ventrículo é um órgão essencial para a digestão do pólen e néctar/mel; no intestino posterior, o controle osmótico ocorre por meio da absorção de água e íons2. As glândulas hipofaríngeas (HPGs) das operárias das abelhas estão localizadas na cabeça e sintetizam e secretam componentes de geleia real para alimentar a ninhada, a rainha e os membros da colônia. Seu tamanho muda com a idade e as tarefas e depende de uma nutrição adequada (pólen de qualidade). Enfermeiros trabalhadores com idade entre 6 e 18 dias realizam a criação de ninhadas, e o tamanho dos HPGs aumenta 5,6. Nas abelhas forrageiras, os HPGs degeneram e apenas secretam enzimas importantes para converter os açúcares complexos em açúcares simples (α-glucosidases, leucina arilamidase, invertase) no mel7.
As abelhas são expostas a vários estressores bióticos e abióticos8, e o trato digestivo pode ser afetado por vários estimulantes negativos. A primeira barreira que protege o organismo de patógenos é a membrana peritrófica no intestino médio, que consiste na mucosa intestinal para proteção contra patógenos4. O desenvolvimento e a função dos HPGs dependem da dieta, da idade e da condição dacolônia9, e são afetados por inseticidas, acaricidas 10 e patógenos11,12,13. Os resíduos de acaricidas na colmeia devido ao tratamento de controle de varroa e os agrotóxicos do ambiente afetam abelhas forrageiras e abelhas enfermeiras14,15. A maior ameaça às colônias de abelhas é o ácaro Varroa destructor, tanto como vetor de vírus que contribuem para a perda de colônias16 quanto como consumidor do corpo gordo do hospedeiro (importante órgão vital nas abelhas), o que, consequentemente, afeta o corpo do indivíduo e as funções da colônia17.
No entanto, habitats intensivos de terras agrícolas podem fornecer um suprimento de alimentos a curto prazo para as abelhas. Por conseguinte, os regimes agro-ambientais devem aumentar a disponibilidade de flores de mel nas paisagens agrícolas18. Para avaliar a morfologia de diferentes subespécies 6,19,20,21 ou os efeitos subletais desses fatores nos níveis celular ou tecidual, especialmente intestino médio e HPGs, métodos histológicos e imuno-histoquímicos são práticos e suficientemente precisos para serem utilizados em pesquisas histológicas em abelhas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em organismos vivos, a morte celular é definida como apoptose ou necrose25 e pode ser acompanhada de autofagia26. A diferença entre células apoptóticas e necróticas é que a apoptose é uma forma de morte celular programada e aparece em células normais, enquanto a necrose ocorre devido a condições letais (por exemplo, acidente, doença)27,28. A apoptose pode ser detectada usando kits de ensaio baseados na t?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradeço o apoio da Agência Eslovena de Investigação, subvenção n.º P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
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