أساسيات الأنسجة واكتشاف موت الخلايا في أنسجة نحل العسل
Summary
الطرق المناعية الكيميائية مفيدة في أبحاث نحل العسل لاكتشاف وتقييم مستوى موت الخلايا المبرمج والنخر في الغدد الوسطى والبلعومية للنحل البالغ.
Abstract
يتعرض نحل العسل (Apis mellifera L.) داخل الخلية (عمال التمريض ونحل الخلية الآخر) وخارج الخلية (العلافين) للتغيرات المناخية والطقس ، والمبيدات الحشرية المختلفة ، ومسببات الأمراض ، وسوء التغذية ، ويدخل بشكل رئيسي عن طريق الفم ويؤثر بشكل أساسي على الجهاز الهضمي للنحل البالغ. لفهم ومنع آثار هذه الضغوطات الخارجية والداخلية على نحل العسل ، فإن إحدى طرق البحث المفيدة هي الطريقة المناعية. يوصف بروتوكول أساسي لإعداد الأمعاء الوسطى (البطين) والغدد البلعومية (HPGs) للنحل البالغ للتحليل النسيجي. يتم وصف منهجية مفصلة لتقييم مستوى تلف الخلايا والتمييز بين النخر وموت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) كعملية طبيعية لتجديد الأنسجة. يتم عرض نتائج علاج نحل العسل للبالغين بحمض الأكساليك والمبيدات الحشرية (المبيدات الحشرية والمبيدات الحشرية) وتحديد موت الخلايا في البطين و HPGs. كما تتم مناقشة إيجابيات وسلبيات المنهجية.
Introduction
نحل العسل (Apis mellifera L.) هي ، من بين الملقحات البرية الأخرى ، أهم الملقحات للنباتات الزراعية. على مدى آلاف السنين ، أثرت البيئة المتغيرة على النحل لتكييف مورفولوجيته وعلم وظائف الأعضاء والسلوك والتسامح مع العديد من مسببات الأمراض والطفيليات. لذلك ، طور نحل العسل مجموعة متنوعة للغاية من الأنواع والأنواع الفرعية حول العالم1. تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة ، أن هناك تباينا وراثيا في بنية الجهاز الهضمي لنحل العسل ، ولكنها تشير أيضا إلى أن التغيرات في الأمعاء الوسطى ترجع إلى عوامل بيئية 2,3.
يتكون الجهاز الهضمي لنحل العسل من ثلاثة أجزاء رئيسية: الأمعاء الأمامية ، الأمعاء الوسطى (البطين) ، والأمعاء الخلفية4. البطين هو عضو أساسي لهضم حبوب اللقاح والرحيق / العسل. في الأمعاء الخلفية ، يحدث التحكم التناضحي من خلال امتصاص الماء والأيونات2. توجد الغدد النفعية البلعومية (HPGs) لعمال نحل العسل في الرأس وتوليف وإفراز مكونات غذاء ملكات النحل لإطعام الحضنة والملكة وأعضاء المستعمرة. يتغير حجمها مع تقدم العمر والمهام ويعتمد على التغذية السليمة (حبوب اللقاح عالية الجودة). يقوم عمال التمريض الذين تتراوح أعمارهم بين 6 و 18 يوما بتربية الحضنة ، ويزيد حجم HPGs 5,6. في نحل العلف ، تتحلل HPGs وتفرز فقط الإنزيمات المهمة لتحويل السكريات المعقدة إلى سكريات بسيطة (α-glucosidases ، leucine arylamidase ، invertase) في العسل7.
يتعرض نحل العسل للعديد من الضغوطات الحيوية وغير الحيوية8 ، ويمكن أن يتأثر الجهاز الهضمي بالعديد من المنشطات السلبية. الحاجز الأول الذي يحمي الكائن الحي من مسببات الأمراض هو الغشاء المحيطي في الأمعاء الوسطى ، والذي يتكون من الغشاء المخاطي المعوي للحماية من مسببات الأمراض4. يعتمد تطور ووظيفة HPGs على النظام الغذائي والعمر وحالة المستعمرة9 ، وتتأثر بالمبيدات الحشرية والمبيدات الحشرية10 ومسببات الأمراض11،12،13. بقايا مبيدات القراد في الخلية بسبب معالجة مكافحة الفاروا والمبيدات الحشرية من البيئة تؤثر على نحل العلف والنحل الممرض14,15. أكبر تهديد لمستعمرات نحل العسل هو مدمر سوس الفاروا ، كناقل للفيروسات التي تساهم في خسائر المستعمرة16 وكمستهلك لجسم المضيف الدهني (عضو حيوي مهم في نحل العسل) ، مما يؤثر بالتالي على جسم الفرد ووظائف المستعمرة17.
ومع ذلك ، يمكن أن توفر موائل الأراضي الزراعية المكثفة إمدادات غذائية قصيرة الأجل لنحل العسل. لذلك ، يجب أن تعزز المخططات الزراعية البيئية توافر زهور العسل في المناظر الطبيعية الزراعية18. لتقييم مورفولوجيا الأنواع الفرعية المختلفة6،19،20،21 أو التأثيرات شبه المميتة لهذه العوامل على مستوى الخلية أو الأنسجة ، وخاصة الأمعاء الوسطى و HPGs ، فإن الطرق النسيجية والكيميائية المناعية عملية ودقيقة بما يكفي لاستخدامها في أبحاث الأنسجة في نحل العسل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الكائنات الحية ، يعرف موت الخلايا بأنه موت الخلايا المبرمج أو النخر25 ويمكن أن يكون مصحوبا بالالتهام الذاتي26. الفرق بين الخلايا المبرمج والخلايا الميتة هو أن موت الخلايا المبرمج هو شكل من أشكال موت الخلايا المبرمج ويظهر في الخلايا الطبيعية ، بينما يحدث النخر ب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أقر بامتنان بدعم وكالة الأبحاث السلوفينية ، المنحة رقم P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
