Основы гистологии и обнаружение гибели клеток в ткани медоносных пчел
Summary
Иммуногистохимические методы полезны в исследованиях медоносных пчел для выявления и оценки уровня апоптоза и некроза в средней кишке и гипофарингеальных железах взрослых пчел.
Abstract
Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) внутри улья (медсестры и другие пчелы-ульи) и вне улья (фуражиры) подвергаются воздействию изменений климата и погоды, различных пестицидов, патогенов и недоедания, в основном попадая через рот и в первую очередь поражая пищеварительный тракт взрослых пчел. Чтобы понять и предотвратить воздействие таких внешних и внутренних стрессоров на медоносных пчел, одним из полезных методов исследования является иммуногистохимический метод. Описан базовый протокол подготовки средней кишки (желудочковой) и гипофарингеальной желез (ГПГ) взрослых пчел к гистологическому анализу. Описана подробная методика оценки уровня повреждения клеток и отличия некроза от запрограммированной гибели клеток (апоптоза) как естественного процесса регенерации тканей. Представлены результаты обработки взрослых медоносных пчел щавелевой кислотой и пестицидами (инсектицидами и акарицидами) и определения гибели клеток в желудочках и ГПГ. Также обсуждаются плюсы и минусы методики.
Introduction
Медоносные пчелы (Apis mellifera L.) являются, среди других диких опылителей, наиболее важными опылителями сельскохозяйственных растений. На протяжении тысячелетий изменяющаяся окружающая среда влияла на пчел, чтобы адаптировать их морфологию, физиологию, поведение и толерантность к нескольким патогенам и паразитам. Поэтому медоносные пчелы развили очень разнообразный диапазон видов и подвидов по всему земному шару1. Эти результаты согласуются с предыдущими выводами о том, что существует генетическая вариация в структуре пищеварительного тракта медоносной пчелы, но также предполагают, что изменения средней кишки обусловлены факторами окружающей среды 2,3.
Пищеварительный тракт медоносной пчелы состоит из трех основных частей: передней кишки, средней кишки (ventriculus) и задней кишки4. Желудочек является важным органом для переваривания пыльцы и нектара/меда; в задней кишке осмотический контроль происходит путем поглощения воды и ионов2. Гипофарингеальные железы (HPG) работников медоносных пчел расположены в голове и синтезируют и выделяют компоненты маточного молочка для питания расплода, матки и членов колонии. Их размер меняется с возрастом и задачами и зависит от правильного питания (качественная пыльца). Работники медсестер в возрасте от 6 до 18 дней занимаются выращиванием расплода, а размер HPG увеличивается на 5,6. У пчел-фуражиров HPG дегенерируют и выделяют только ферменты, которые важны для превращения сложных сахаров в простые (α-глюкозидазы, лейцинариламидазы, инвертазы) вмеде 7.
Медоносные пчелы подвергаются воздействию нескольких биотических и абиотических стрессоров8, а на пищеварительный тракт могут влиять несколько негативных стимуляторов. Первым барьером, защищающим организм от болезнетворных микроорганизмов, является перитрофическая мембрана в средней кишке, которая состоит из слизистой оболочки кишечника для защиты от болезнетворных микроорганизмов4. Развитие и функция HPG зависят от диеты, возраста и состояния колонии9 и подвержены влиянию инсектицидов, акарицидов10 и патогенов 11,12,13. Остатки акарицидов в улье из-за контрольной обработки варроа и пестицидов из окружающей среды влияют на пчел-фуражиров ипчел-кормилиц 14,15. Наибольшую угрозу для колоний медоносных пчел представляет клещ Варроа-деструктор, как переносчик вирусов, способствующих потерям колоний16, так и как потребитель жирового тела хозяина (важный жизненно важный орган у медоносных пчел), который, следовательно, влияет на организм человека и функции колонии17.
Тем не менее, интенсивные места обитания сельскохозяйственных угодий могут обеспечить краткосрочное снабжение продовольствием для медоносных пчел. Поэтому агроэкологические схемы должны повысить доступность медоносных цветов в сельскохозяйственных ландшафтах18. Для оценки морфологии различных подвидов 6,19,20,21 или сублетальных эффектов этих факторов на клеточном или тканевом уровнях, особенно средней кишки и HPG, гистологические и иммуногистохимические методы являются практичными и достаточно точными для использования в гистологических исследованиях у медоносных пчел.
Protocol
Representative Results
Discussion
У живых организмов гибель клеток определяется как апоптоз или некроз25 и может сопровождаться аутофагией26. Разница между апоптотическими и некротическими клетками заключается в том, что апоптоз является формой запрограммированной гибели клеток и появляется …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я с благодарностью отмечаю поддержку Словенского исследовательского агентства, грант No P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
