Histologi Grunnleggende og Cell Death Detection i Honeybee Tissue
Summary
Immunhistokjemiske metoder er nyttige i honningbieforskning for å oppdage og vurdere nivået av apoptose og nekrose i midgut og hypopharyngeal kjertler av voksne bier.
Abstract
Honningbier (Apis mellifera L.) inne i bikuben (sykepleierarbeidere og andre bikube) og utenfor bikuben (foragere) er utsatt for klima- og værendringer, ulike plantevernmidler, patogener og underernæring, som hovedsakelig kommer inn gjennom munnen og primært påvirker fordøyelseskanalene til voksne bier. For å forstå og forhindre effekten av slike eksterne og interne stressorer på honningbier, er en nyttig forskningsmetode den immunhistokjemiske metoden. En grunnleggende protokoll er beskrevet for å forberede midgut (ventriculus) og hypopharyngeal kjertler (HPGs) av voksne bier for histologisk analyse. En detaljert metodikk er beskrevet for å vurdere nivået av celleskade og skille nekrose fra programmert celledød (apoptose) som en naturlig prosess for vevregenerering. Resultatene av voksen honningbiebehandling med oksalsyre og plantevernmidler (insektmiddel og akaricid) og bestemmelse av celledød i ventriculus og HPG presenteres. Fordeler og ulemper med metodikken diskuteres også.
Introduction
Honningbier (Apis mellifera L.) er blant annet ville pollinatorer de viktigste pollinatorene av landbruksplanter. Gjennom tusenvis av år har det skiftende miljøet påvirket bier til å tilpasse sin morfologi, fysiologi, oppførsel og toleranse til flere patogener og parasitter. Derfor har honningbier utviklet et svært variert utvalg av arter og underarter over hele verden1. Disse resultatene er i samsvar med tidligere funn, at det er genetisk variasjon i honningbiens fordøyelseskanalstruktur, men antyder også at endringer i midttarmen skyldes miljøfaktorer 2,3.
Fordøyelseskanalen til honningbien har tre hoveddeler: foregut, midgut (ventriculus) og hindgut4. Ventriculus er et viktig organ for fordøyelsen av pollen og nektar / honning; I hindgut foregår osmotisk kontroll gjennom absorpsjon av vann og ioner2. Hypopharyngeal kjertler (HPGs) av honningbiearbeidere er plassert i hodet og syntetiserer og utskiller kongelige gelékomponenter for å mate brystet, dronningen og medlemmene av kolonien. Deres størrelse endres med alder og oppgaver og avhenger av riktig ernæring (kvalitetspollen). Sykepleierarbeidere i alderen 6 til 18 dager utfører oppdrett, og størrelsen på HPG øker 5,6. I foragerbier degenererer HPG-ene og utskiller bare enzymer som er viktige for å konvertere de komplekse sukkerene til enkle (α-glukosidaser, leucin arylamidase, invertase) i honning7.
Honningbier er utsatt for flere biotiske og abiotiske stressorer8, og fordøyelseskanalen kan påvirkes av flere negative stimulanter. Den første barrieren som beskytter organismen mot patogener er den peritrofiske membranen i midttarmen, som består av tarmslimhinnen for å beskytte mot patogener4. Utviklingen og funksjonen til HPG avhenger av kosthold, alder og kolonitilstand9, og påvirkes av insektmidler, akaricider 10 og patogener11,12,13. Akaricidrester i bikuben på grunn av varroa-kontrollbehandling og plantevernmidler fra miljøet påvirker foragerbier og sykepleierbier14,15. Den største trusselen mot honningbiekolonier er midden Varroa destructor, både som en vektor av virus som bidrar til kolonitap16 og som forbruker av vertens fete kropp (et viktig vitalt organ i honningbier), som følgelig påvirker individets kropp og kolonifunksjoner17.
Imidlertid kan intensive jordbrukshabitater gi en kortsiktig matforsyning for honningbier. Derfor bør miljøordninger for landbruket øke tilgjengeligheten av honningblomster i jordbrukslandskap18. For å vurdere morfologien til forskjellige underarter 6,19,20,21 eller subletale effekter av disse faktorene på celle- eller vevsnivå, spesielt midgut og HPG, er histologiske og immunhistokjemiske metoder praktiske og tilstrekkelig nøyaktige til å brukes i histologiforskning hos honningbier.
Protocol
Representative Results
Discussion
I levende organismer er celledød definert som apoptose eller nekrose25 og kan ledsages av autofagi26. Forskjellen mellom apoptotiske og nekrotiske celler er at apoptose er en form for programmert celledød og vises i normale celler, mens nekrose oppstår på grunn av dødelige forhold (f.eks. Ulykke, sykdom)27,28. Apoptose kan detekteres ved hjelp av analysesett basert på TUNEL-teknikken (påvisning avDNA-fragment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jeg takker for støtten fra det slovenske forskningsbyrået, bevilgning nr. P4-133.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
