Summary
В видеостатье кратко изложена техника панкреатэктомии и аллотрансплантации поджелудочной железы в 3-дневной модели выживания свиней с пошаговым описанием метода и акцентом на хирургические советы и рекомендации по борьбе с ненадежной и деликатной висцеральной анатомией свиньи.
Abstract
Несмотря на многообещающие результаты трансплантации поджелудочной железы при сахарном диабете 1 типа и метаболическом синдроме, самой большой проблемой, связанной с этим современным методом, остается нехватка органов, считающихся пригодными для трансплантации. Высокое внутрисосудистое сопротивление, тонкий внутрипаренхиматозный капиллярный каркас и сложная дольковая анатомия вокруг брыжеечной сосудистой сети делают этот орган более восприимчивым к травмам и менее устойчивым к тривиальным травмам по сравнению с такими органами, как печень и почки. Тщательное хирургическое вскрытие и разумное обращение с тканями являются краеугольным камнем всей трансплантации поджелудочной железы. Из-за морфологического сходства между анатомией поджелудочной железы свиньи и окружающими брыжеечными сосудами и органами по сравнению с анатомией человека, демонстрация техники в модели свиньи может помочь наиболее точно экстраполировать это на условия человека. Настоящая статья направлена на то, чтобы изложить основные хирургические советы и приемы, которым необходимо следовать, чтобы обеспечить более высокий уровень успеха трансплантации этого высокочувствительного органа в 3-дневной модели выживания свиньи.
Introduction
За последние несколько десятилетий был достигнут значительный прогресс в стратегиях периоперационного ведения и хирургических методах, что привело к превращению трансплантации поджелудочной железы в одну из наиболее перспективных стратегий лечения сахарного диабета с терминальной стадией почечной недостаточности (обычно в сочетании с трансплантацией почки)1 . Тем не менее, такие осложнения, как трансплантатный панкреатит, ишемия-реперфузионное повреждение и тромбоз сосудов, остаются самыми большими проблемами, которые необходимо преодолеть для обеспечения успешных результатов, особенно в более поврежденных трансплантатах с расширенными критериями2. Кроме того, трансплантаты поджелудочной железы являются наиболее часто выбрасываемыми трансплантатами при закупке и имеют самые низкие коэффициенты использования (9%) для любого органа3. Таким образом, машинная перфузия направлена на обеспечение оптимальной гомеостатической среды для трансплантата поджелудочной железы с целью увеличения коэффициента использования трансплантата, аналогично тому, что было достигнуто при трансплантации печени, почек и легких4. Анатомия поджелудочной железы свиньи сложна с точки зрения ее дольковой архитектуры (состоящей из трех долей), ее расширений по всей брыжеечно-портальной оси, ее вариаций брыжеечного сосуда (в 40-50%) и ее тонких сосудистых каналов вдоль С-петли 5-перстной кишки. Эти анатомические признаки способствуют сложному рассечению как при извлечении трансплантата поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки, так и при панкреатэктомии реципиента, чтобы вызвать ятрогенное состояние апанкреатического диабета, т.е. хирургически индуцированное состояние сахарного диабета с уровнем глюкозы натощак выше 8 ммоль / л. Основываясь на этих особенностях, панкреатэктомия свиней с трансплантацией обеспечивает максимально возможную репликацию техники, которая может быть выполнена на людях в качестве окончательного лечения против терминальной стадии сахарный диабет. Настоящая статья направлена на освещение следующих аспектов: (i) описание периоперационного ухода за свиньями во время реципиентной панкреатэктомии и имплантации трансплантата поджелудочной железы; (ii) технические пошаговые сведения о панкреатэктомии реципиента и имплантации панкреато-дуоденального трансплантата и (iii) советы и рекомендации по операции на поджелудочной железе донора и реципиента на моделях свиней для минимизации травм трансплантата и реципиента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол получил этическое одобрение Комитета по уходу за животными Главного научно-исследовательского института Торонто. Животные получали гуманный уход в соответствии с Национальным обществом медицинских исследований и Руководством по уходу за лабораторными животными, Национальный институт здравоохранения (NIH), Онтарио, Канада. Для этого исследования были использованы 15-недельные неродственные йоркширские свиньи весом 40-50 кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь протокол исследования разделен на следующие основные этапы: (i) извлечение органов и подготовка к работе за столом; (ii) Реципиентная тотальная панкреатэктомия и (iii) имплантация трансплантата. Вся операция донора и реципиента делается за 1 день.
1. Забор донорских органов и подготовка заднего стола
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод извлечения органов был описан в отдельном протоколе6. Тем не менее, протокол вкратце описан здесь вместе с некоторыми дополнительными моментами, характерными для хирургической техники (хирургические советы, относящиеся к донорской операции).
- Короче говоря, обезболить свинью-донора и закрепить дыхательные пути и центральный венозный катетер (описано ниже в разделе панкреатэктомии реципиента). Надрежьте и обнаживите внутренности. Выполнить расслоение и мобилизацию аортокавала до бифуркации в подвздошные сосуды.
- Обработка кишечника: Тонкая кишка свиньи длинная и извилистая, а толстая кишка в основном растянута. Обязательно перемещайте петли кишечника в их анатомическое положение после каждого этапа донорской операции, чтобы обеспечить адекватную перфузию и избежать возможности перекрута брыжейки.
- Расслоение прикорневой стенки: перевязать и разделить артериальные ветви и желчный проток, чтобы обнажить воротную вену. Рассеките шишку (гепато-дуоденальную связку) как можно выше/дистальнее, чтобы избежать риска повреждения небольших сосудистых каналов, которые перфузируют верхнюю часть поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Начинайте скелетировать сосуды справа налево, пока передняя поверхность воротной вены не обнажена.
- Аорто-кавальное расслоение: обнажите надпеченочную инфрадиафрагмальную часть аорты путем разделения диафрагмальной круры. Избегайте рассечения нижней полой вены вокруг панкреато-дуоденальной рощи. Используйте почечные артерии с обеих сторон в качестве отмеченной верхней границы рассечения.
- Обнажите поджелудочную железу, открыв малый мешок. Перевязывают и разделяют почечные артерии. Канюляция инфраренальной аорты и подключение к раствору Университета Висконсина (UW) для промывания.
- Перекрывают надпеченочную аорту и зажимают. Промойте 1,5-2 л раствора UW, чтобы обеспечить адекватное промывание кишечника и поджелудочной железы (о чем свидетельствует внешний вид бледности). Во время промывания органа in situ переместите тонкую кишку и толстую кишку последовательно к средней линии, чтобы предотвратить скручивание брыжеечной. Этот шаг обеспечивает равномерное промывание кишечника и поджелудочной железы раствором UW (Университет Висконсина) и важно помнить.
- Разрезайте воротную вену и полую вену подпечения одновременно после начала промывки, чтобы выпустить венозные стоки. Покройте живот льдом, чтобы обеспечить холодную перфузию. Рассекают орган (панкреатодуоденальный трансплантат с частями забрюшинного пространства, поясничной мышцы, селезенки и надпочечников) в массовом порядке.
- Холодная диссекция: Начните мобилизацию трансплантата от латерального к медиальному направлению, от хвоста поджелудочной железы к месту соединения между головкой и телом, путем резкого рассечения фасции между поджелудочной железой и толстой кишкой. Выполняя этот шаг, удерживайте поджелудочную железу за забрюшинное покрытие щипцами и попросите помощника дать встречное вытяжение толстой кишке по направлению к стопе.
- Брыжеечный зажим: Разделив тонкую ткань вокруг тела поджелудочной железы, дуоденоеюнальной петли и толстой кишки, попросите помощника обвить брыжеечную ножку и потянуть петлю толстой кишки каудально. Это обеспечит разграничение брыжейки и безопасное размещение зажима для последовательного разделения крупных брыжеечных сосудов без повреждения паренхимы поджелудочной железы.
- Полное экстраперитонеальное рассечение трансплантата: после разделения брыжеечных сосудов начните извлечение трансплантата путем рассечения от медиального к латеральному против часовой стрелки, разделяя внепанкреатические ткани, включая парапочечную фасцию, надпочечники, манжету IVC, поясничную мышцу и диафрагмальную голени. Обеспечьте адекватную плоскость вдали от аорты, чтобы избежать травмирования верхних брыжеечной и целиакии.
- Подготовьте задний стол на льду. Хранят орган в ящике со льдом (время холодной ишемии 5 ч).
2. Реципиентная панкреатэктомия
- Предоперационная подготовка
- Постите животное не менее 6 часов до установленного времени индукции. Вводят инъекцию, содержащую мидазолам (0,15 мг / кг), атропин (0,04 мг / кг) и кетамин (25 мг / кг) подкожно (/к), за 15 минут до транспортировки животного в операционную (операционную). Вводят бупренорфин 0,3 мг для инъекций с замедленным высвобождением/к за 15 мин до транспортировки в операционную.
- Положение: Положите животное на спину на операционный стол и запрягите передние конечности, чтобы обеспечить стабильное положение во время операции.
- Дыхательные пути и индукция: Проветривайте животное с помощью мешка и маски с 3-5% изофлураном и 2-3 л кислорода в минуту, подключая датчик пульсоксиметра и контролируя частоту сердечных сокращений и сатурациюO2 .
- После адекватного расслабления, подтвержденного расслаблением челюстей и стабильным насыщением кислородом и частотой сердечных сокращений, попросите помощника подержать открытый рот с адекватным вытяжением на расслабленных верхней и нижней челюстях животного и визуализируйте голосовые связки с помощью ларингоскопа. Распылите 2% лидокаин, чтобы расслабить голосовые связки, чтобы предотвратить спазмы, вызванные интубацией (голосовые связки свиньи очень сосудистые и хрупкие!).
- Интубируют с помощью эндотрахеальной трубки диаметром 7 мм и надувают манжету, используя 3-5 мл воздуха. Обеспечьте положение трубки с помощью датчика CO 2 (ETCO2) в конце выдоха и подключите трубку к аппарату искусственной вентиляции легких со скоростью 14-16 вдохов в минуту для достижения дыхательного объема 10-15 мл / кг. Понизьте изофлуран до 2,5% в качестве поддерживающей дозы ингаляционной анестезии.
- Внутривенная линия: асептически подготовьте место операции бетадином и поместите стерильную драпировку. Затем определите ориентир для размещения центрального венозного катетера, который является центроидом треугольника, образованного между сосцевидным отростком, акромионным отростком и головкой ключицы. Используйте иглу 16 G, чтобы проколоть вену; после обеспечения свободного потока венозной крови, очевидного по цвету и отсутствию пульсации, вводят проводниковую проволоку по методике Сельдингера.
- Расширьте тракт с помощью прилагаемого расширителя. Замените проводник и расширитель катетером 8,5 x 10 Fr и закрепите на месте, наложив швы иглой для резки шелковых швов 0-0. Соедините внутривенную линию с внутривенными антибиотиками, содержащими цефазолин (1 г) и метронидазол (500 мг), после чего проводят внутривенную анестезию путем инфузии пропофола со скоростью 10 мл / ч.
- Инвазивный мониторинг артериального давления: После асептической подготовки места операции бетадином наложите стерильную простыню и сделайте разрез параллельно трахее на расстоянии 2 см от средней линии. Рассекают волокна грудино-сосцевидной мышцы и паратрахеальной фасции путем тупого рассечения с помощью прямоугольных щипцов Лахея и гемостатических щипцов.
- Определите яремную вену, расположенную латерально по отношению к волокнам ремешковых мышц, и рассеките вдоль мышцы, отделив ее от сонной артерии медиально, используя тупое рассечение, как описано выше. Определите артерию по ее пульсации, текстуре (пуповинообразной) и периваскулярному сплетению. Мобилизуйте судно и перевязьте его с помощью двух шелковых стяжек 2-0.
- Проколите сосуд ангиокатетером 16 G со скошенным наконечником, направленным вверх, и извлеките внутренний стилет, оказавшись внутри сосуда. Сдвиньте внешнюю оболочку катетера с помощью техники Сельдингера и подключите выходное отверстие к системе измерения артериального давления (АД). Перед подключением инвазивного монитора АД откалибруйте показания до нуля, чтобы обеспечить точную запись и закрепить катетер на месте с помощью шелковых стяжек.
- Контроль температуры и подогрев: Поместите датчик для записи температуры перорально. Накройте животное нагревательным одеялом Bair-hugger и обеспечьте температуру 37-38 °C. Смажьте глаза нейтральным смазывающим гелем для глаз. Покрасьте и задрапируйте операционное поле
- Хирургическое вмешательство
ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа асептически подготавливается ко всем хирургическим процедурам с использованием бетадиновых скрабов с последующим размещением стерильных простыней.- Разрез и воздействие: Сделайте разрез по средней линии от мечегруди до лобкового симфиза, используя чистый режим резки электрокоагуляции Бови. Убедитесь, что вы держитесь латерально к мочеиспускательному каналу в нижней части разреза за фаллосом, чтобы избежать травм. Установите самоудерживающий ретрактор брюшной стенки, стараясь не травмировать селезенку и печень, оптимизировать воздействие на операционное поле.
- Мобилизация головки поджелудочной железы: С помощью помощника, обеспечивающего противодействие панкреато-дуоденальной роще, начните с рассечения вдоль аваскулярной фасциальной плоскости между паренхимой поджелудочной железы (долей двенадцатиперстной кишки) и подпеченочным НПВ.
- Мобилизация кольца поджелудочной железы: Поджелудочная железа свиньи образует кольцо вокруг оси брыжеечного портала (соединительная доля). Рассеките вдоль фасции по обоим сторонам воротной вены (PV), чтобы обеспечить полную мобилизацию соединительной доли от вышележащей PV. Самый безопасный способ — начать рассечение по обе стороны от воротной вены и разделить ткани по окружности по часовой стрелке или против часовой стрелки.
- Мобилизация хвоста поджелудочной железы: Затем определите соединение между панкреатической и парапочечной тканями (видимое как белая линия) и начните рассекать хвост от нижележащей селезеночной вены, оставаясь близко к паренхиме. Перевязывают и разделяют мелкие венозные притоки к паренхиме, стараясь не травмировать селезеночную вену, используя шелковые галстуки 3/0.
- Мобилизация тела поджелудочной железы: Рассеките вдоль тонкого слоя ткани, отделяющего паренхиму от толстой кишки и желудка, заботясь о сохранении тонкой сосудистой аркады вдоль инфра-пилорической области.
- Панкреато-дуоденальная мобилизация: Затем отделите паренхиму от С-петли двенадцатиперстной кишки путем резкого рассечения в панкреато-дуоденальной роще с помощью тракционно-встречного вытяжения, заботясь о сохранении тонкой сосудистой аркады вдоль С-петли двенадцатиперстной кишки.
- Разделение протока поджелудочной железы: Определите проток поджелудочной железы, перевязайте шелковыми стяжками 2-0 и разделите, держа культю протока около 3-5 мм на петле С двенадцатиперстной кишки, держась подальше от дуоденальной сосудистой аркады (в тесной связи с протоком).
- Удаление образца: Завершите последнюю часть мобилизации, рассекая паренхиму от соединения между соединительной долей, двенадцатиперстной кишкой и толстой кишкой по обе стороны от воротной вены. Извлеките образец в массе (рис. 1), разделив соединительный лепесток на передней стороне PV. Деление паренхимы требуется для извлечения образца из-за его окружного расположения вокруг PV.
- Обеспечьте гемостаз вдоль областей рассечения и осмотрите двенадцатиперстную кишку на предмет повреждений и застоя сосудов (рис. 2).
- Имплантация панкреато-дуоденального трансплантата
- Подготовка трансплантата: Подготовьте трансплантат PV и проксимальный конец аорты, обрезав края для анастомоза. Поместите подготовленный трансплантат в органный мешок с раствором UW на ледяной бане. Возьмите биопсию из хвоста поджелудочной железы - храните формалин, заморозьте и извлеките РНК на более позднем этапе. Зашить место биопсии с помощью Prolene 6-0 в виде цифры 8.
- Аорто-кавальная диссекция: Начните с определения правого мочеточника и рассеките вдоль фасции, отделяющей мочеточник от забрюшинного покрытия над нижней полой веной. Рассеките вдоль боковой границы аорты, чтобы обнажить ее от нижележащей поясничной мышцы. Затем рассеките вдоль межаортокавальной рощи, чтобы отделить аорту от IVC.
- Зажимной тест: Обеспечьте адекватную мобилизацию аорты и НПВ путем исследования установки сосудистого зажима Сатинского. Поменяйтесь положением с первым помощником и подготовьте операционное поле, втянув петли кишечника с левой стороны, чтобы обнажить основные сосуды для анастомоза. Установите пробные зажимы на НПВ и аорту, чтобы повторно оценить адекватную мобилизацию обоих сосудов для анастомоза.
- Венозный анастомоз: После установки сосудистого зажима в IVC сделайте небольшое отверстие в передней стенке сосуда и расширьте его до адекватного размера (в соответствии с сосудом трансплантата) краниально и каудально с помощью ножниц Потта. Промойте просвет гепаринизированным физиологическим раствором, используя гибкую оболочку канюли для внутривенного вливания.
- Используя двойную иглу Prolene 6-0, сделайте угловые швы на IVC (изнутри-наружу) и воротную вену трансплантата (изнанку-наружу). Закрепите каудальный угловой шов и непрерывно проведите одной из игл вдоль задней стенки трансплантата и вены-реципиента. Закрепите переднюю стенку аналогичным (снаружи-непрерывно) способом и закрепите узел в центре передней стенки после промывки просвета анастомоза гепаринизированным физиологическим раствором.
- Снятие пережатия вены: поместите сосудистый зажим бульдога на воротную вену трансплантата, подальше от анастомоза, и медленно отпустите боковой зажим от реципиента IVC. Проверьте, нет ли венозного наполнения и значительного кровотечения из анастомоза.
- Артериальный анастомоз: Поместите боковой зажим на аорту, стараясь не повредить поясничные ветви вдоль задней стенки сосуда. Попросите анестезиолога ввести гепарин (100 ЕД/кг массы тела) и метилпреднизолон (500 мг) через центральный венозный катетер.
- Сделайте отверстие на передней стенке сосуда и вытяните его краниально и каудально, стараясь не рассекать стенку сосуда. Промойте просвет гепаринизированным физиологическим раствором и с помощью двойной иглы Prolene 6-0 непрерывно сшивайте проксимальный конец аорты трансплантата с отверстием аорты реципиента с помощью техники парашюта. Промойте просвет гепаринизированным физиологическим раствором, прежде чем завязывать последний узел на передней стенке сосуда.
- Реперфузия: При выполнении этого шага позаботьтесь о следующих двух аспектах. Во-первых, гемодинамические изменения, при которых происходит резкое падение среднего АД. Контролируйте инвазивное АД от минуты к минуте и выполняйте титрование дозы вазопрессора (инфузия норадреналина) и предварительную загрузку жидкости, чтобы поддерживать целевое среднее АД в пределах 45-50 мм рт.ст.
- Во-вторых, поддерживать гемостаз. После удаления бульдожьего зажима из вены оцените наличие значительного кровотечения из паренхимы, парааортальной области и перипортальной области; Затем отпустите зажим аорты и проверьте, нет ли кровотечения из места артериального анастомоза. Закрепите точки кровотечения лигатурами и кровоостанавливающими швами. Попросите анестезиолога ввести флакон с транексамовой кислотой через центральный венозный катетер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важным правилом является минимизация агрессивного воздействия на поджелудочную железу во время этой фазы реперфузии (чтобы избежать отека трансплантата и гематомы). - Анастомоз кишечника: Убедившись, что перекрут брыжеечной кишки отсутствует, изолируйте петлю тощей кишки на расстоянии 40-50 см от дуоденогеунального соединения и поднесите ее близко к трансплантату. Анастомозируйте трансплантат двенадцатиперстной кишки к реципиентной тощей кишке непрерывно из стороны в сторону, используя шов Polydioxanone 4-0, стараясь обеспечить достаточный диаметр просвета 1,5-2 см.
- Гемостаз и постреперфузионная биопсия: Обеспечьте гемостаз вокруг трансплантата и в местах анастомоза. Возьмите три пункционные биопсии из хвоста поджелудочной железы через 1 ч после реперфузии - храните формалин, мгновенно замораживайте и извлекайте РНК на более позднем этапе. Зашить место биопсии проленом 6-0 по рисунку 8.
- Закрытие брюшной стенки: После оценки удержания швабры и обеспечения гемостаза непрерывно сшивайте прямую мышцу живота с помощью иглы полидиоксанона 0, заботясь о нижней средней линии, чтобы держаться подальше от уретры. Закройте кожу с помощью шва silk 0 непрерывным образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале рекомендуются монофиламентные швы (нейлон); Однако, поскольку это 3-дневная модель выживания, шелк приемлем в этих экспериментальных моделях. - Обвязка центрального венозного катетера: Создайте подкожный туннель на шее и закрепите центральный венозный катетер, закопав его под туннелем и зашив вышележащую кожу шелковой режущей иглой 0-0.
- Удаление артериального катетера: После обеспечения стабильного среднего АД (40-50 мм рт.ст.) и тенденции к улучшению рН и уровня лактата при анализе газов крови удалите артериальный катетер и перевязать сосуд для обеспечения гемостаза в области шеи. Закройте вышележащую кожу шелковым швом 0 непрерывным образом.
- Положение животного и экстубация: Соблюдая все необходимые меры предосторожности, переверните животное на транспортировочную тележку. Наблюдайте за насыщениемO2 и обращением анестезии вспять (движение конечностей, спонтанные дыхательные усилия, SpO 2 >95% от O2 и поддержка аппарата искусственной вентиляции легких) и экстубируйте животное. Транспортируйте в загон и расположите животное за грудиной и следите за гемодинамическим состоянием до стабильного состояния.
Рисунок 1: Образец панкреатэктомии, резецированный в массовом порядке. Обратите внимание на кольцо ткани поджелудочной железы, окружающее воротную вену in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображение двенадцатиперстной кишки. С-петля двенадцатиперстной кишки с сохраненной сосудистой аркадой (наконечником стрелки) сравнивается с окружающей тощей петлей и оценивается на предмет застойных явлений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Периоперационные и послеоперационные, до 3 дней, биохимические параметры из пяти моделей выживания при трансплантации поджелудочной железы приведены ниже (пронумерованы как PTX от 1 до 5 в хронологии). Из пяти трансплантаций поджелудочной железы все хорошо себя чувствовали в течение 3-дневного периода выживания, о чем свидетельствует их общее самочувствие, повреждение поджелудочной железы и тесты эндокринной функции. Результаты, представленные ниже, являются репрезентативными для опыта 3-дневной модели выживания реципиентной панкреатэктомии с последующей аллотрансплантацией поджелудочной железы после статического холодного хранения трансплантата.
Среднее время операции панкреатэктомии составило 52 мин (45-64 мин). Поскольку это была модель с мертвым сердцем, у донора не было фазы асистолической теплой ишемии. Среднее время теплой ишемии реципиента от применения бокового зажима для полой кости до реперфузии трансплантата составило 49,5 мин (40-55 мин). Все пять трансплантатов имели время холодной ишемии 5 часов (300 минут) в соответствии с протоколом исследования. Все животные получали иммуносупрессию в виде 300 мг Сипа циклоспорина два раза в день.
Периоперационные клинические и биохимические показатели
Средняя частота сердечных сокращений через 1 ч после реперфузии составила 135 уд/мин (120-170 уд/мин). Среднее артериальное давление составляло 37 мм рт.ст. (30-55 мм рт.ст.), обычно поддерживалось под прикрытием высокой дозы инфузии норадреналина. Во всех пяти случаях норадреналин можно было сузить и прекратить, прежде чем переместить животное обратно в загон. Уровень лактата контролировали в операционной в течение 3 ч после реперфузии. Тенденция представлена на рисунке 3.
Рисунок 3: Уровни лактата в сыворотке крови после реперфузии трансплантата. Тренд измеряли в течение первых 3 ч реперфузии. Ось Y представляет значения лактата (в ммоль/л). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Биохимические показатели послеоперационного клинического и панкреатического поражения
Все пять животных были клинически бдительными, о чем свидетельствуют активные движения конечностей и дыхание, в течение 5-6 часов после реперфузии. Все они были активны, принимали пероральное питание и лекарства и сдавали мочу и стул к утру 1-го послеоперационного дня.
Послеоперационные уровни амилазы в течение первых 3 дней обобщены на рисунке 4.
Рисунок 4: Уровни амилазы в сыворотке крови после реперфузии трансплантата. Тренд измеряли в течение первых 3 дней после трансплантации. Ось Y представляет собой уровни амилазы (Ед/л). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Послеоперационные уровни липазы в сыворотке крови в течение первых 3 дней приведены на рисунке 5.
Рисунок 5: Уровни липазы в сыворотке крови после реперфузии трансплантата. Тренд измеряли в течение первых 3 дней после трансплантации. Ось Y представляет уровни липазы (Ед/л). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Послеоперационные уровни лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови приведены ниже на рисунке 6.
Рисунок 6: Уровни ЛДГ в сыворотке крови после реперфузии трансплантата. Тенденция измерялась в течение первых 3 дней после трансплантации. Ось Y представляет уровни ЛДГ (ЕД/Л). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Послеоперационный глюкозотолерантный тест
На третий послеоперационный день был проведен 120-минутный внутривенный глюкозотолерантный тест. Доза 50 мл, содержащая 50% декстрозы, вводили через центральный венозный катетер, и время регистрировалось как 0 мин. Образцы крови были взяты впоследствии через 2 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин и обработаны на уровень глюкозы. Оставшуюся часть образца центрифугировали при 8000 x g в течение 10 мин, а надосадочную жидкость хранили в трех микроцентрифужных пробирках при -80 °C. На рисунке 7 показана тенденция теста на толерантность к глюкозе для пяти случаев (PTX 1-5).
Рисунок 7: Уровни глюкозы в сыворотке, оцениваемые с помощью теста на толерантность к глюкозе внутривенно. Уровни глюкозы в сыворотке оценивали через 0-120 минут с помощью внутривенного теста на толерантность к глюкозе и сравнивали между PTX 1-5. Ось Y представляет уровень глюкозы (ммоль/л). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий протокол был выполнен для демонстрации техники и возможности панкреатэктомии и аллотрансплантации поджелудочной железы на моделях свиней. Животных наблюдали в течение 3 дней после трансплантации, чтобы продемонстрировать надежность техники панкреатэктомии и аллотрансплантации. Все животные находились под наблюдением и выхаживались в течение 3 дней после операции с использованием стандартизированного протокола ухода за животными, состоящего из антибиотиков, жидкостей, анальгетиков, дополнительного питания и иммунодепрессантов (например, циклоспорина). Они были принесены в жертву на третий послеоперационный день (через 72 часа или раньше, если это требуется из-за клинического ухудшения) этически одобренной гуманной техникой. Биопсии были взяты из хвоста, тела, головы и двенадцатиперстной кишки и отправлены на гистопатологический анализ, а остальные срезы хранились в буфере изоляции РНК и мгновенно замораживались (-80 ° C) для последующего использования.
Одна из самых ранних попыток успешной демонстрации индукции ятрогенного сахарного диабета в модели свиней с помощью панкреатэктомии была опубликована Chaiba et al. в 2011 году в когорте из 10 белых самцов свиней весом 27-33 кг7. Группа продемонстрировала анатомические плоскости и ориентиры, создав дорожную карту для успешной панкреатэктомии на моделях свиней. Prudhomme et al. в 2020 году продемонстрировали возможность индукции диабета и аллотрансплантации поджелудочной железы в своей когорте из трех свиней-самцов Susscrofa8. Индукцию сахарного диабета оценивали по уровню С-пептида через 3 ч после тотальной панкреатэктомии. Медицинская индукция сахарного диабета у йоркширских свиней была успешно продемонстрирована Grussner et al. в 1993 году с коэффициентом смертности 0% в когорте из 67 йоркширских свиней ландраса9. Успешная индукция диабета с помощью панкреатэктомии оценивалась с использованием уровня глюкозы в сыворотке крови, руководствуясь клиническим благополучием животного нашей группой (Mazilescu et al.) в 2022 году10. После установления успешной индукции наша группа приступила к аллотрансплантации поджелудочной железы после панкреатэктомии на следующем этапе протокола.
Важным ограничением исследования является обеспечение равномерной воспроизводимости во всех когортах животных. В основном это связано с хрупкостью свиной модели с точки зрения склонности к сезонному гриппу, зоонозу и т. д. Эти факторы могут способствовать негативному искажению результатов независимо от техники, используемой для операции.
Факторы, влияющие на исход трансплантации поджелудочной железы, включают предоперационные состояния, такие как общее самочувствие, сердечно-легочный статус, сезонная инфекция и периоперационные состояния, такие как состояние трансплантата в конце машинной перфузии, обращение с трансплантатом во время операции, гемодинамические изменения при реперфузии11. С хирургической точки зрения сведение к минимуму обработки трансплантата in vivo и ex situ играет важную роль в обеспечении имплантации минимально поврежденного трансплантата в этой крайне опасной модели трансплантации12. Изменения в составе перфузионного раствора, диализирующего раствора и физиологических параметров во время машинной перфузии также могут определять исход трансплантации и в настоящее время оцениваются группой. Создание успешной модели аллотрансплантации в трансплантатах с машинной перфузией может еще больше проложить путь для трансплантатов с расширенными критериями, таких как донорство после сердечной смерти (DCD) и расширенное холодное хранение (ECS) поджелудочной железы в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Belzer UW Cold storage solution | Bridge to life Ltd (Columbia, SC, USA) | 4055 | |
| Calcium gluconate (10%) | Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON) | C360019 | |
| Composelect (blood collection bags) | Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON) | PQ31555 | |
| Heparin (10000 IU/10 ml) | Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON) | C504710 | |
| Lactated Ringer's | Baxter (Mississauga, ON, Canada) | JB2324 | |
| Percutaneous Sheath Introducer Set with Integral Hemostasis Valve/side Port for use with 7-7.5 Fr Catheters | Arrow International LLC | SI-09880 | |
| Sodium bicarbonate (8.4%) | Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON) | C908950 | |
| Solu-Medrol | Pfizer Canada Inc. | 52246-14-2 | |
| Surgical retreival and transplant instrument set |
References
- Gruessner, R. W., Gruessner, A. C. The current state of pancreas transplantation. Nature Reviews. Endocrinology. 9 (9), 555-562 (2013).
- Redfield, R. R., Rickels, M. R., Naji, A., Odorico, J. S.
- Canadian Institute for Health Information. Annual Statistics on Organ Replacement in Canada: Dialysis, Tranplantation and Donation, 2009 to 2018. Canadian Institute for Health Information. , Ottawa, ON: CIHI. (2019).
- Prudhomme, T., et al. Ex-situ perfusion of pancreas for whole-organ transplantation: Is it safe and feasible?A systematic review. Journal of Diabetes Science and Technology. 14 (1), 120-134 (2020).
- Ferrer, J., et al. Pig pancreas anatomy: Implications for pancreas procurement, preservation, and islet isolation. Transplantation. 86 (11), 1503-1510 (2008).
- Parmentier, C., et al. Normothermic ex vivo pancreas perfusion for the preservation of pancreas allografts before transplantation. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Chaib, E., et al. Total pancreatectomy: Porcine model for inducing diabetes - Anatomical assessment and surgical aspects. European Surgical Research. 46 (1), 52-55 (2011).
- Prudhomme, T., et al. Total pancreatectomy and pancreatic allotransplant in a porcine experimental model. Experimental and Clinical Transplantation. 18 (3), 353-358 (2022).
- Grussner, R., et al.
- Mazilescu, L. I., et al. Normothermic ex situ pancreas perfusion for the preservation of porcine pancreas grafts. American Journal of Transplantation. 22 (5), 1339-1349 (2022).
- Kumar, R., et al. Ex vivo normothermic porcine pancreas: A physiological model for preservation and transplant study. International Journal of Surgery. 54, 206-215 (2018).
- Kaths, J. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion for the preservation of kidney grafts prior to transplantation. Journal of Visualized Experiments. (101), e52909 (2015).
