本方案描述了一种利用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼胚胎中实现精确基因敲入编辑的方法。同时提供了一套表型分析流程，以证明该技术在模拟与长QT综合征相关基因变异中的应用价值。
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本文内容
摘要
摘要
动物模型中的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）可实现对生理现象研究的精确基因操作。斑马鱼作为一种有效的遗传学模型，已被广泛用于在器官和整体生物水平上研究与遗传性疾病、发育过程及毒理学相关的诸多科学问题。由于斑马鱼基因组已被充分注释并完成图谱绘制，目前已开发出多种基因编辑工具。然而，利用CRISPR技术进行精确敲入编辑的效率以及检测的便捷性仍是当前的限制因素。本文介绍了一种基于CRISPR-Cas9的敲入方法，并通过检测一个与心脏复极化相关且与电生理紊乱疾病——长QT综合征（Long QT Syndrome, LQTS）有关的基因中发生的精确编辑，展示了该方法的简便检测流程。该方法采用两条单导向RNA（sgRNA），可切除并替换目标序列，同时插入一个基因编码的报告基因。通过描述对野生型和基因编辑斑马鱼幼体进行非侵入性的心脏电生理表型测量，验证了该方法的应用价值。该策略可在完整生物体中高效研究疾病相关变异体，同时为插入外源性目的序列（如报告基因、直系同源基因或基因编辑工具）提供了新的可能性。
引言
基于CRISPR的基因编辑策略在动物模型中的应用，使得在整体生物水平上研究可遗传的遗传性疾病、发育过程及毒理学成为可能1,2,3。斑马鱼是一种强大的模型，其在多种生理特征上比小鼠或人源细胞模型更接近人类4。斑马鱼已被广泛应用于正向5和反向遗传筛选6，并开发了大量遗传工具和策略。斑马鱼中全面的遗传图谱构建与基因注释工作，促进了基因编辑技术的发展，使其成为实现靶向基因敲除（KOs）和精确基因敲入（KIs）的主要手段7。
尽管如此，斑马鱼中精确的敲入（KI）编辑仍受限于较低的效率以及准确检测的困难。虽然转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已成功用于并优化了敲入编辑8，CRISPR 技术凭借更简单的 sgRNA 靶向方式提供了更优的基因编辑策略。大量研究已利用 CRISPR 在斑马鱼中实现精确的敲入编辑9,10....
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方案
斑马鱼相关研究均遵循西蒙菲莎大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会的政策与程序，并在协议编号 #1264K-18 下完成。
1. 精确编辑的 CRISPR 组分设计
- 为了设计用于切除包含敲入（KI）靶位点序列的双sgRNA引导序列，首先确定目标基因的斑马鱼同源基因。
注意：图2 概括了使用双sgRNA CRISPR-Cas9方法实现精确编辑的步骤。 - 接下来，使用设计软件工具（例如CRISPOR24），选择物种为Danio rerio，并选择将使用的Cas酶。
注意：本研究中的目标基因为zkcnh6a（Ensembl转录本ID：ENSDART00000090809.6；UniProt蛋白ID：B3DJX4），目标突变为氨基酸R56Q。- 对于双sgRNA方法，选择一个位于目标外显子上游的sgRNA位点，以及另一个位于其紧邻下游内含子内的sgRNA位点。
- 确保所选sgRNA具有高特异性且预测的脱靶结合率低。利用CRISPOR评分系统筛选脱靶结合最少的引导序列。不考虑在潜在脱靶位点的种子序列中无错配的引导序列。
- 根据CRISPOR评分，确定最可能的潜在脱靶位点（选择前三....
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结果
通过在斑马鱼的zkcnh6a基因中引入并简便检测精确编辑，成功构建了与长QT综合征相关的R56Q变异，凸显了这种双sgRNA外显子替换CRISPR方法的有效性。图6显示了一例在单细胞胚胎阶段注射了上述CRISPR组分的代表性3天龄幼鱼。图6A显示眼晶状体中YFP mVenus报告基因的表达，表明模板成功整合。图6B和C分别为从野生型鱼和报告基因阳性鱼尾部组织样本中提取基因组DNA后获得的Sanger测序色谱图。检测发现，报告基因阳性鱼均存在G到A的精确编辑，该编辑将R56Q变异引入zkcnh6a基因。基因分型结果显示YFP报告基因表达与R56Q精确基因编辑之间存在100%的相关性，验证了该荧光筛选工具的可靠性。
在3 dpf时对基因编辑的斑马鱼幼鱼进行表型分析。图7展示了野生型.......
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讨论
利用 CRISPR-Cas9 实现精确基因编辑面临同源定向修复（HDR）机制效率低下以及难以高效检测的挑战。本文介绍了一种基于 CRISPR-Cas9 的双 sgRNA 外显子替换方法，可在斑马鱼中实现精确编辑，并通过直观的视觉方式检测阳性编辑结果。通过在 zkcnh6a 基因中产生精确编辑，验证了该方法的有效性。本文还展示了如何通过心率、心包尺寸和心电图形态等非侵入性表型指标，评估基因编辑斑马鱼幼虫的心脏功能。从引入基因编辑到完成表型分析，整个流程可在约 1 周内完成。
上述编辑和表型分析方法的优势在于CRISPR修饰设计简便、在多种生理系统中具有广泛适用性、能够插入较大的基因或基因片段，以及能够长期追踪变异在发育过程和多代之间的效应。该方法实现精确编辑的成功可能与大尺寸模板（包含报告基因插入片段和较长的同源臂）有关，已知这可提高斑马鱼中编辑的效率14；同时也可能得益于双sgRNA引导策略，该策略此前已在斑马鱼TALEN介导的编辑中被有效应用8。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由加拿大卫生研究院项目资助（T.W.C.）以及加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（T.W.C.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 程序 | |||
| CRISPOR | TEFOR 基础设施 | ||
| ENSEMBL | 欧洲生物信息研究所 | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 (NIH) | ||
| Micro-Manager | 开源 (Github) | ||
| NEBiocalculator | 新英格兰生物实验室 (NEB) | ||
| 设备 | |||
| 24孔板 | VWR | ||
| 25 mm 培养皿 | VWR | ||
| Blackfly USB3 相机 | Teledyne FLIR | ||
| C1000 热循环仪 | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C 离心机 | Eppendorf | ||
| EZNA 凝胶回收试剂盒 | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 转录试剂盒 | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 恒温摇床 | Barnstead Lab Line | ||
| 质粒小提试剂盒 | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra 转录试剂盒 | Invitrogen | ||
| ND1000 分光光度计 | Nanodrop | ||
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | ||
| PLI 100A 皮升注射仪 | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic 电源供应器 | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 体视显微镜 | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT 电泳系统 | Bio-Rad | ||
| ZebTec 斑马鱼饲养系统 | Tecniplast | ||
| 服务 | |||
| 基因合成 | Genewiz | ||
| Sanger 测序 | Genewiz | ||
| 试剂 | |||
| 10β 感受态细胞 | NEB | ||
| 10X PCR 缓冲液 | Qiagen | ||
| 100 mM 核苷酸混合物 | ABM | ||
| 氨苄青霉素 | Sigma | ||
| BamHI 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| BsaI 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| DR274 质粒（XL1 Blue 细菌琼脂斜面） | Addgene | ||
| EcoRI 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| 甘油 | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| 卡那霉素 | Sigma | ||
| 亚甲蓝 | Sigma | ||
| MLM3613 质粒（XL1 Blue 细菌琼脂斜面） | Addgene | ||
| MS-222（三卡因） | Sigma | ||
| pKHR5 质粒（DH5α 细菌琼脂斜面） | Addgene | ||
| PmeI 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| SalI 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| 氢氧化钠 | Sigma | ||
| T4 连接酶（含缓冲液） | Sigma | ||
| Taq 聚合酶 | Qiagen | ||
| TE 缓冲液 | Sigma | ||
| Tris 盐酸盐 | Sigma | ||
| XhoI 内切酶（含缓冲液） | NEB | ||
| 配方 | |||
| 溶液 | 组分 | 供应商 | |
| 退火缓冲液（pH 7.5–8.0） | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 培养基（pH 7.2） | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| 注射缓冲液（pH 7.5） | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
参考文献
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models.
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重印与许可
