CRISPR-Cas9-опосредованные точные правки в сердцах рыбок данио
Summary
Этот протокол описывает подход к облегчению точного внесения изменений в эмбрионы рыбок данио с использованием технологии CRISPR-Cas9. Представлен конвейер фенотипирования, чтобы продемонстрировать применимость этих методов для моделирования варианта гена, связанного с синдромом удлиненного интервала QT.
Abstract
Кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) на животных моделях позволяют проводить точные генетические манипуляции для изучения физиологических явлений. Рыбки данио использовались в качестве эффективной генетической модели для изучения многочисленных вопросов, связанных с наследственными заболеваниями, развитием и токсикологией на уровне всего органа и организма. Благодаря хорошо аннотированному и нанесенному на карту геному рыбки данио были разработаны многочисленные инструменты для редактирования генов. Тем не менее, эффективность генерации и простота обнаружения точных изменений с использованием CRISPR является ограничивающим фактором. Здесь описан подход на основе CRISPR-Cas9 с простым обнаружением точных изменений в гене, ответственном за реполяризацию сердца и связанном с электрическим расстройством, синдромом длинного QT (LQTS). Этот подход с двумя одноруковой РНК (sgRNA) иссекает и заменяет целевую последовательность и связывает генетически закодированный ген-репортер. Полезность этого подхода демонстрируется описанием неинвазивных фенотипических измерений электрической функции сердца у личинок рыбок данио дикого типа и генетически отредактированных. Такой подход позволяет эффективно изучать связанные с заболеванием варианты в целом организме. Кроме того, эта стратегия предлагает возможности для вставки экзогенных последовательностей по выбору, таких как репортерные гены, ортологи или редакторы генов.
Introduction
Стратегии редактирования генов на основе CRISPR на животных моделях позволяют изучать генетически наследственные заболевания, развитие и токсикологию на уровне всего организма 1,2,3. Рыбки данио представляют собой мощную модель, которая ближе во многих физиологических аспектах к людям, чем мышиные или человеческие клеточные модели4. Обширный спектр генетических инструментов и стратегий был использован у рыбок данио как для прямого5, так и для обратного генетического скрининга6. Всестороннее генетическое картирование и аннотация рыбок данио облегчили подходы к редактированию генов в качестве основного метода для разработки целевых нокаутов генов (KOs) и точных нокаутов (KIs)7.
Несмотря на это, генерация точных изменений KI у рыбок данио ограничена низкой эффективностью и сложностью точного обнаружения. Хотя транскрипционные эффекторные нуклеазы (TALEN) были успешно использованы и оптимизированы для KIs8, CRISPR обеспечивает улучшенную стратегию редактирования генов с более простым таргетированием sgRNA. Многочисленные исследования использовали CRISPR для получения точных KIs у рыбок данио 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, хотя эти изменения, полученные с помощью CRISPR-опосредованного гомологического восстановления (HDR), как правило, неэффективны с низким внутренним успехом. показатели, требующие генотипирования в качестве основного экрана 9,10,14,21. Это демонстрирует необходимость эффективной системы KI CRISPR у рыбок данио, а также надежной высокопроизводительной системы для обнаружения точных правок.
Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать платформу для генерации точного сердечного гена KI в сердцах рыбок данио с простым и высокопроизводительным обнаружением успешных правок. Описан подход замены экзонов на основе CRISPR-Cas9 с двумя сгРНК, который основан на подходеTALEN 8. Этот подход включает в себя иссечение целевой последовательности с использованием двух сгРНК-направляющих и замену экзогенной шаблонной последовательностью, содержащей интересующий КИ, а также генетически закодированный интронный ген-репортер (рисунок 1). Интеграция генетически закодированного флуоресцентного репортера в интронную последовательность гена-мишени позволяет эффективно обнаруживать положительные изменения. Затем описывается фенотипирующая платформа для оценки электрической функции сердца у личинок рыбок данио для неинвазивной характеристики вариантов генов, связанных с унаследованным LQTS, сердечным электрическим расстройством, которое предрасполагает людей к внезапной сердечной смерти.
Эти подходы расширят доступ и использование изменений генов KI рыбок данио для моделирования наследственных заболеваний и решения биологических и физиологических вопросов, таких как картирование паттернов экспрессии генов и регуляция развития. Поскольку сердца рыбок данио лучше соответствуют сердечным электрофизиологическим характеристикам человека, чем мышиные модели, они могут быть особенно привлекательными в качестве генетически трактуемой системы для моделирования сердечных заболеваний 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Разработка точных изменений генов с использованием CRISPR-Cas9 оспаривается низкой эффективностью механизмов HDR и их эффективным обнаружением. Здесь описан подход замены экзонов на основе CRISPR-Cas9 с двумя сгРНК, который производит точные изменения у рыбок данио с простым визуальным обнаруже…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом Канадского исследовательского проекта Института здравоохранения (T.W.C.) и грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
