CRISPR-Cas9-gemedieerde nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisharten
Summary
Dit protocol beschrijft een aanpak om nauwkeurige knock-in bewerkingen in zebravisembryo’s te vergemakkelijken met behulp van CRISPR-Cas9-technologie. Een fenotyperingspijplijn wordt gepresenteerd om de toepasbaarheid van deze technieken aan te tonen om een long QT-syndroom-geassocieerde genvariant te modelleren.
Abstract
Geclusterde regelmatig tussen elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR) in diermodellen maken nauwkeurige genetische manipulatie mogelijk voor de studie van fysiologische verschijnselen. Zebravissen zijn gebruikt als een effectief genetisch model om tal van vragen met betrekking tot erfelijke ziekten, ontwikkeling en toxicologie op het niveau van het hele orgaan en het organisme te bestuderen. Vanwege het goed geannoteerde en in kaart gebrachte zebravisgenoom zijn er talloze hulpmiddelen voor genbewerking ontwikkeld. De effectiviteit van het genereren en het gemak van het detecteren van nauwkeurige knock-in bewerkingen met CRISPR is echter een beperkende factor. Hier beschreven is een CRISPR-Cas9-gebaseerde knock-in benadering met de eenvoudige detectie van nauwkeurige bewerkingen in een gen dat verantwoordelijk is voor cardiale repolarisatie en geassocieerd met de elektrische aandoening, Long QT Syndrome (LQTS). Deze twee-single-guide RNA (sgRNA) benadering snijdt en vervangt de doelsequentie en koppelt een genetisch gecodeerd reporter-gen. Het nut van deze aanpak wordt aangetoond door het beschrijven van niet-invasieve fenotypische metingen van de cardiale elektrische functie in wildtype en gen-bewerkte zebravislarven. Deze aanpak maakt een efficiënte studie van ziekte-geassocieerde varianten in een heel organisme mogelijk. Bovendien biedt deze strategie mogelijkheden voor het invoegen van exogene sequenties naar keuze, zoals reportergenen, orthologen of geneditors.
Introduction
Crispr-gebaseerde genbewerkingsstrategieën in diermodellen maken de studie van genetisch erfelijke ziekten, ontwikkeling en toxicologie op het niveau van het hele organismemogelijk 1,2,3. Zebravissen bieden een krachtig model dat in tal van fysiologische aspecten dichter bij de mens staat dan muizen- of van de mens afgeleide celmodellen4. Een uitgebreid scala aan genetische hulpmiddelen en strategieën is gebruikt in zebravissen voor zowel voorwaartse5 als omgekeerde genetische screening6. Uitgebreide genetische mapping en annotatie in zebravissen hebben genbewerkingsbenaderingen vergemakkelijkt als een primaire techniek om gerichte gen knock-outs (KO’s) en precieze knock-ins (KPI’s) te engineeren7.
Desondanks wordt het genereren van nauwkeurige KI-bewerkingen in zebravissen beperkt door lage efficiënties en de moeilijkheidsgraad van nauwkeurige detectie. Hoewel transcriptiefactorachtige effectornucleasen (TALENs) met succes zijn gebruikt en geoptimaliseerd voor KPI’s8, biedt CRISPR een verbeterde genbewerkingsstrategie met eenvoudigere sgRNA-targeting. Talrijke studies hebben CRISPR gebruikt om precieze KPI’s te genereren in zebravissen 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, hoewel deze bewerkingen gegenereerd door CRISPR-gemedieerde homologie-gerichte reparatie (HDR) meestal inefficiënt zijn met een laag intrinsiek succes tarieven die genotypering als primair scherm vereisen 9,10,14,21. Dit toont de behoefte aan een efficiënt KI CRISPR-systeem in zebravissen, evenals een betrouwbaar high-throughput systeem voor het detecteren van nauwkeurige bewerkingen.
Het doel van deze studie was om een platform te beschrijven voor het genereren van een nauwkeurig hartgen KI in zebravisharten met eenvoudige en high-throughput detectie van succesvolle bewerkingen. Er wordt een CRISPR-Cas9-gebaseerde twee-sgRNA exonvervangingsbenadering beschreven, die gebaseerd is op een TALEN-benadering8. Deze benadering omvat excisie van de doelsequentie met behulp van twee-sgRNA-geleiders en vervanging door een exogene sjabloonsequentie die de KI van belang bevat, evenals een genetisch gecodeerd intronisch reportergen (figuur 1). De integratie van een genetisch gecodeerde fluorescerende reporter in de intronische sequentie van het doelgen maakt de efficiënte detectie van positieve bewerkingen mogelijk. Een fenotyperingsplatform wordt vervolgens beschreven voor het beoordelen van de cardiale elektrische functie in zebravislarven voor niet-invasieve karakterisering van de genvarianten geassocieerd met erfelijke LQTS, een cardiale elektrische aandoening die individuen vatbaar maakt voor plotselinge hartdood.
Deze benaderingen zullen de toegang tot en het gebruik van zebravis KI-genbewerkingen verbeteren om erfelijke ziekten te modelleren en biologische en fysiologische vragen aan te pakken, zoals het in kaart brengen van genexpressiepatronen en ontwikkelingsregulatie. Omdat zebravisharten beter parallelle menselijke cardiale elektrofysiologische kenmerken hebben dan muizenmodellen, kunnen ze bijzonder aantrekkelijk zijn als een genetisch hanteerbaar systeem voor hartaandoeningen met 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
De engineering van nauwkeurige genbewerkingen met CRISPR-Cas9 wordt uitgedaagd door de lage efficiëntie van HDR-mechanismen en hun efficiënte detectie. Hier wordt een CRISPR-Cas9-gebaseerde twee-sgRNA exon vervangingsbenadering beschreven die nauwkeurige bewerkingen in zebravissen produceert met eenvoudige visuele detectie van positieve bewerkingen. De werkzaamheid van deze aanpak wordt aangetoond door het genereren van nauwkeurige bewerkingen in het zkcnh6a-gen . Dit artikel laat zien hoe de hartfunctie in ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door een Canadian Institutes of Health Research Project grant (T.W.C.) en Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery grants (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. . Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
