Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish
Summary
Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l’applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.
Abstract
Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) in modelli animali consentono una precisa manipolazione genetica per lo studio dei fenomeni fisiologici. I pesci zebra sono stati utilizzati come modello genetico efficace per studiare numerose domande relative alla malattia ereditaria, allo sviluppo e alla tossicologia a livello di intero organo e organismo. Grazie al genoma del pesce zebra ben annotato e mappato, sono stati sviluppati numerosi strumenti per l’editing genetico. Tuttavia, l’efficacia della generazione e la facilità di rilevare modifiche precise utilizzando CRISPR è un fattore limitante. Qui è descritto un approccio knock-in basato su CRISPR-Cas9 con la semplice rilevazione di modifiche precise in un gene responsabile della ripolarizzazione cardiaca e associato al disturbo elettrico, la sindrome del QT lungo (LQTS). Questo approccio a due RNA a guida singola (sgRNA) asporta e sostituisce la sequenza bersaglio e collega un gene reporter geneticamente codificato. L’utilità di questo approccio è dimostrata descrivendo misure fenotipiche non invasive della funzione elettrica cardiaca in larve di zebrafish wild-type e geneticamente modificate. Questo approccio consente lo studio efficiente delle varianti associate alla malattia in un intero organismo. Inoltre, questa strategia offre possibilità per l’inserimento di sequenze esogene di scelta, come geni reporter, ortologhi o editor di geni.
Introduction
Le strategie di editing genetico basate su CRISPR in modelli animali consentono lo studio di malattie, sviluppo e tossicologia geneticamente ereditabili a livello dell’intero organismo 1,2,3. I pesci zebra forniscono un modello potente che è più vicino in numerosi aspetti fisiologici agli esseri umani rispetto ai modelli cellulari murini o derivati dall’uomo4. Una vasta gamma di strumenti e strategie genetiche sono stati utilizzati nel pesce zebra sia per lo screening genetico in avanti5 che per lo screening genetico inverso6. La mappatura genetica completa e l’annotazione nel pesce zebra hanno facilitato gli approcci di modifica genetica come tecnica primaria per progettare knockout genici mirati (KO) e knock-in precisi (KI)7.
Nonostante ciò, la generazione di modifiche KI precise nel pesce zebra è limitata dalle basse efficienze e dalla difficoltà di un rilevamento accurato. Sebbene le nucleasi effettrici simili al fattore di trascrizione (TALEN) siano state utilizzate con successo e ottimizzate per i KI8, CRISPR fornisce una migliore strategia di modifica genetica con un targeting più semplice degli sgRNA. Numerosi studi hanno utilizzato CRISPR per generare KI precisi nel pesce zebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, sebbene queste modifiche generate attraverso la riparazione diretta dall’omologia mediata da CRISPR (HDR) tendano ad essere inefficienti con un basso successo intrinseco Tassi che richiedono la genotipizzazione come schermo primario 9,10,14,21. Ciò dimostra la necessità di un efficiente sistema KI CRISPR nel pesce zebra, nonché di un sistema affidabile ad alto rendimento per rilevare modifiche precise.
L’obiettivo di questo studio era quello di descrivere una piattaforma per generare un preciso gene cardiaco KI nei cuori di zebrafish con un rilevamento semplice e ad alto rendimento delle modifiche riuscite. Viene descritto un approccio di sostituzione dell’esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9, basato su un approccio TALEN8. Questo approccio prevede l’escissione della sequenza bersaglio utilizzando due guide di sgRNA e la sostituzione con una sequenza modello esogena che contiene il KI di interesse e un gene reporter intronico geneticamente codificato (Figura 1). L’integrazione di un reporter fluorescente geneticamente codificato all’interno della sequenza intronica del gene bersaglio consente l’individuazione efficiente di modifiche positive. Viene quindi descritta una piattaforma di fenotipizzazione per valutare la funzione elettrica cardiaca nelle larve di zebrafish per la caratterizzazione non invasiva delle varianti genetiche associate alla LQTS ereditaria, una malattia elettrica cardiaca che predispone gli individui alla morte cardiaca improvvisa.
Questi approcci miglioreranno l’accesso e l’uso delle modifiche del gene KI del pesce zebra per modellare le malattie ereditarie e affrontare questioni biologiche e fisiologiche, come la mappatura dei modelli di espressione genica e la regolazione dello sviluppo. Poiché i cuori di zebrafish sono più simili alle caratteristiche elettrofisiologiche cardiache umane rispetto ai modelli murini, possono essere particolarmente interessanti come sistema geneticamente trattabile per la modellazione di malattie cardiache 7,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ingegneria di precisi edit genetici utilizzando CRISPR-Cas9 è messa in discussione dalle basse efficienze dei meccanismi HDR e dal loro rilevamento efficiente. Qui, viene descritto un approccio di sostituzione dell’esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9 che produce modifiche precise nel pesce zebra con rilevamento visivo diretto di modifiche positive. L’efficacia di questo approccio è dimostrata generando modifiche precise nel gene zkcnh6a . Questo articolo mostra come la funzione cardiaca nelle larve di ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) e dalle sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery (T.W.C.).
Materials
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
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