CRISPR-Cas9-medierade exakta knock-in-redigeringar i zebrafiskhjärtan

Summary

Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för att underlätta exakta knock-in-redigeringar i zebrafiskembryon med CRISPR-Cas9-teknik. En fenotypningspipeline presenteras för att demonstrera tillämpligheten av dessa tekniker för att modellera en lång QT-syndromassocierad genvariant.

Abstract

Grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR) i djurmodeller möjliggör exakt genmanipulation för studier av fysiologiska fenomen. Zebrafisk har använts som en effektiv genetisk modell för att studera många frågor relaterade till ärftlig sjukdom, utveckling och toxikologi på helorgan- och -organismnivå. På grund av det väl kommenterade och kartlagda zebrafiskgenomet har många verktyg för genredigering utvecklats. Effektiviteten av att generera och underlätta att upptäcka exakta knock-in-redigeringar med CRISPR är dock en begränsande faktor. Här beskrivs en CRISPR-Cas9-baserad knock-in-metod med enkel detektering av exakta redigeringar i en gen som är ansvarig för hjärtrepolarisering och associerad med den elektriska störningen, Long QT Syndrome (LQTS). Detta två-en-guide-RNA (sgRNA) tillvägagångssätt skär ut och ersätter målsekvensen och länkar en genetiskt kodad reportergen. Nyttan av detta tillvägagångssätt demonstreras genom att beskriva icke-invasiva fenotypiska mätningar av hjärtats elektriska funktion i vildtyp och genredigerade zebrafisklarver. Detta tillvägagångssätt möjliggör effektiv studie av sjukdomsassocierade varianter i en hel organism. Dessutom erbjuder denna strategi möjligheter för införande av exogena sekvenser av val, såsom reportergener, ortologer eller genredigerare.

Introduction

CRISPR-baserade genredigeringsstrategier i djurmodeller möjliggör studier av genetiskt ärftlig sjukdom, utveckling och toxikologi på helorganismnivå ^1,2,3. Zebrafiskar ger en kraftfull modell som i många fysiologiska aspekter är närmare människor än murina eller mänskliga härledda cellmodeller⁴. Ett omfattande utbud av genetiska verktyg och strategier har använts i zebrafisk för både framåt⁵ och omvänd genetisk screening⁶. Omfattande genetisk kartläggning och annotering hos zebrafisk har underlättat genredigeringsmetoder som en primär teknik för att konstruera riktade genknockouts (KO) och exakta knock-ins (KIs)⁷.

Trots detta begränsas genereringen av exakta KI-redigeringar i zebrafisk av låg effektivitet och svårigheten att exakt upptäcka. Även om transkriptionsfaktorliknande effektornukleaser (TALENs) framgångsrikt har använts och optimerats för KIs⁸, ger CRISPR en förbättrad genredigeringsstrategi med enklare sgRNA-inriktning. Många studier har använt CRISPR för att generera exakta KI i zebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20^, även om dessa redigeringar som genereras genom CRISPR-medierad homologistyrd reparation (HDR) tenderar att vara ineffektiva med låg inneboende framgång priser som kräver genotypning som primär skärm 9,10,14,21. Detta visar på behovet av ett effektivt KI CRISPR-system inom zebrafisk, samt ett pålitligt system med hög genomströmning för att upptäcka exakta redigeringar.

Målet med denna studie var att beskriva en plattform för att generera en exakt hjärtgen KI i zebrafiskhjärtan med enkel och hög genomströmningsdetektering av framgångsrika redigeringar. En CRISPR-Cas9-baserad två-sgRNA exon-ersättningsmetod beskrivs, som är baserad på en TALEN-metod⁸. Detta tillvägagångssätt involverar excision av målsekvensen med hjälp av två-sgRNA-guider och ersättning med en exogen mallsekvens som innehåller KI av intresse samt en genetiskt kodad intronic reportergen (figur 1). Integrationen av en genetiskt kodad fluorescerande reporter i målgenens introniska sekvens möjliggör effektiv detektion av positiva redigeringar. En fenotypningsplattform beskrivs sedan för att bedöma hjärtats elektriska funktion hos zebrafisklarver för icke-invasiv karakterisering av genvarianterna associerade med ärftlig LQTS, en hjärtelektrisk störning som predisponerar individer för plötslig hjärtdöd.

Dessa tillvägagångssätt kommer att förbättra tillgången till och användningen av zebrafisk-KI-genredigeringar för att modellera ärftliga sjukdomar och ta itu med biologiska och fysiologiska frågor, såsom kartläggning av genuttrycksmönster och utvecklingsreglering. Eftersom zebrafiskhjärtan bättre parallella mänskliga hjärtelektrofysiologiska egenskaper än murina modeller, kan de vara särskilt attraktiva som ett genetiskt lätthanterligt system för hjärtsjukdomsmodellering 7,22,23.

Protocol

Studier med zebrafisk genomfördes i enlighet med policyerna och förfarandena för Simon Fraser University Animal Care Committee och Canadian Council of Animal Care och slutfördes enligt protokoll # 1264K-18. 1. Design av CRISPR-komponenter för exakta redigeringar För att utforma de två-sgRNA-guider som kommer att användas för att skära ut sekvensen som innehåller KI-målstället, identifiera först zebrafiskortologen för genen av intresse.<strong class…

Representative Results

Den framgångsrika användningen av denna två-sgRNA exon-ersättnings-CRISPR-metod framhävs av introduktionen och enkel detektion av en exakt redigering för att konstruera den LQTS-associerade varianten, R56Q, i zkcnh6a-genen i zebrafisk. Figur 6 visar representativa 3 dpf-larver injicerade i encellsembryostadiet med CRISPR-komponenter enligt beskrivningen ovan. Figur 6A visar närvaron av YFP mVenus reportergenuttryck i ögonlinsen som en positiv re…

Discussion

Konstruktionen av exakta genredigeringar med CRISPR-Cas9 utmanas av HDR-mekanismernas låga effektivitet och deras effektiva detektering. Här beskrivs en CRISPR-Cas9-baserad två-sgRNA exon-ersättningsmetod som ger exakta redigeringar i zebrafisk med enkel visuell detektering av positiva redigeringar. Effekten av detta tillvägagångssätt demonstreras genom att generera exakta redigeringar i zkcnh6a-genen . Denna uppsats visar hur hjärtfunktionen hos genredigerade zebrafisklarver kan bedömas med hjälp av i…

Materials

Program
CRISPOR	TEFOR Infrastructure
ENSEMBL	European Bioinformatics Institute
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Micro-Manager	Open Source (Github)
NEBiocalculator	New England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well Plate	VWR
25 mm Petri Dish	VWR
Blackfly USB3 Camera	Teledyne FLIR
C1000 Thermal Cycler	Bio-Rad
Centrifuge 5415C	Eppendorf
EZNA Gel Extraction Kit	Omega Biotek
MAXIscript T7 Transcription Kit	Invitrogen
MaxQ 5000 Incubator	Barnstead Lab Line
Miniprep Kit	Qiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit	Invitrogen
ND1000 Spectrophotometer	Nanodrop
PCR Purification Kit	Qiagen
PLI 100A Picoinjector	Harvard Apparatus
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad
Stemi 305 Steroscope	Zeiss
Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System	Bio-Rad
ZebTec Zebrafish Housing System	Tecniplast
SERVICES
Gene Synthesis	Genewiz
Sanger Sequencing	Genewiz
REAGENTS
10β Competent Cells	NEB
10X PCR Buffer	Qiagen
100 mM Nucleotide Mixture	ABM
Ampicillin	Sigma
BamHI Endonuclease w/ buffer	NEB
BsaI Endonuclease w/ buffer	NEB
DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
EcoRI Endonuclease w/ buffer	NEB
Glycerol
HEPES	Sigma
HindIII Endonuclease w/ buffer	NEB
Kanamycin	Sigma
Methylene Blue	Sigma
MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab)	Addgene
MS-222 (Tricaine)	Sigma
pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab)	Addgene
PmeI Endonuclease w/ buffer	NEB
SalI Endonuclease w/ buffer	NEB
Sodium Hydroxide	Sigma
T4 Ligase w/ buffer	Sigma
Taq Polymerase	Qiagen
TE Buffer	Sigma
Tris Hydrochloride	Sigma
XhoI Endonuclease w/ buffer	NEB
RECIPES
Solution	Component	Supplier
Annealing Buffer (pH 7.5-8.0)	10 mM Tris	Sigma
	50 mM NaCl	Sigma
	1 mM EDTA	Sigma
E3 Media (pH 7.2)	5 mM NaCl	Sigma
	0.17 mM KCl	Sigma
	0.33 mM CaCl2	Sigma
	0.33 mM MgSO4	Sigma
Injection Buffer (pH 7.5)	20 mM HEPES	Sigma
	150 mM KCl	Sigma