Bestemmelse af tarmpermeabilitet ved hjælp af Lucifer Yellow i en apikal enteroidmodel
Summary
Den nuværende protokol skitserer en metode, der anvender lucifer gul i en apikal-out enteroid model til bestemmelse af tarmpermeabilitet. Denne metode kan bruges til at bestemme paracellulær permeabilitet hos enteroider, der modellerer inflammatoriske tarmsygdomme såsom nekrotiserende enterocolitis.
Abstract
Enteroider er et nyt forskningsværktøj i undersøgelsen af inflammatoriske tarmsygdomme såsom nekrotiserende enterocolitis (NEC). De dyrkes traditionelt i den basolaterale ud (BO) konformation, hvor epitelcellens apikale overflade vender mod det indre lumen. I denne model er adgang til den lysende overflade af enteroider til behandling og eksperimentering udfordrende, hvilket begrænser evnen til at studere værtspatogeninteraktioner. For at omgå dette blev der oprettet en neonatal apical-out (AO) model til nekrotiserende enterocolitis. Da ændringer i tarmepitelcellepermeabilitet er patognomoniske for NEC, skitserer denne protokol ved hjælp af lucifer gul (LY) som en markør for paracellulær permeabilitet. LY krydser tarmepitelbarrieren via alle tre store paracellulære veje: pore, lækage og ubegrænset. Brug af LY i en AO-model giver mulighed for en bredere undersøgelse af permeabilitet i NEC. Efter IRB-godkendelse og forældrenes samtykke blev kirurgiske prøver af tarmvæv indsamlet fra humane for tidligt fødte nyfødte. Intestinale stamceller blev høstet via kryptisolering og brugt til at dyrke enteroider. Enteroider blev dyrket til modenhed og derefter omdannet AO eller efterladt i BO-konformation. Disse blev enten ikke behandlet (kontrol) eller blev behandlet med lipopolysaccharid (LPS) og udsat for hypoxiske tilstande til induktion af in vitro NEC. LY blev brugt til at vurdere permeabilitet. Immunofluorescerende farvning af det apikale protein zonula okkluraner-1 og basolateralt protein β-catenin bekræftede AO-konformation. Både AO- og BO-enteroider behandlet med LPS og hypoxi viste signifikant øget paracellulær permeabilitet sammenlignet med kontroller. Både AO- og BO-enteroider viste øget optagelse af LY i lumen af de behandlede enteroider sammenlignet med kontroller. Anvendelsen af LY i en AO enteroid model giver mulighed for undersøgelse af alle tre hovedveje for paracellulær permeabilitet. Det giver desuden mulighed for undersøgelse af værtspatogeninteraktioner, og hvordan dette kan påvirke permeabiliteten sammenlignet med BO enteroidmodellen.
Introduction
Enteroider er tredimensionelle (3D) strukturer afledt af organbegrænsede humane tarmstamceller 1,2. De består udelukkende af epitelafstamning og indeholder alle de differentierede tarmepitelcelletyper2. Enteroider opretholder også cellulær polaritet, der består af en apikal luminal overflade, der danner et indre rum og en basolateral overflade, der vender mod det omgivende medie. Enteroider er en unik model, idet de bevarer egenskaberne ved den vært, hvorfra de blev genereret3. Således repræsenterer enteroider genereret fra for tidlige menneskelige spædbørn en model, der er nyttig til undersøgelse af sygdomme, der primært påvirker denne befolkning, såsom nekrotiserende enterocolitis (NEC).
Den traditionelle enteroidmodel dyrkes i en basolateral-out (BO) konformation, hvor enteroiden er indkapslet i en kuppel af kældermembranmatrix (BMM). BMM inducerer enteroiden til at opretholde en 3D-struktur med den basolaterale overflade på ydersiden. BO-enteroider er en passende model til NEC, der bygger bro mellem todimensionale (2D) primære humane cellelinjer og in vivo-dyremodeller 2,4. NEC induceres i enteroider ved at placere patogener såsom LPS eller bakterier i medierne omkring enteroiderne efterfulgt af eksponering for hypoxiske tilstande 2,3. Udfordringen med BO enteroid NEC-modellen er, at den ikke tillader effektiv undersøgelse af værtspatogeninteraktioner, som forekommer ved den apikale overflade in vivo. Ændringer i tarmpermeabilitet skyldes disse værtspatogeninteraktioner. For bedre at forstå, hvordan permeabilitet påvirker det patofysiologiske grundlag for sygdom, skal der oprettes en model, der involverer behandling af den apikale overflade.
Co et al. var de første til at demonstrere, at modne BO-enteroider kan induceres til at danne en apikal-out (AO) konformation ved at fjerne BMM-kuplerne og resuspending dem i medier5. Denne artikel viste, at AO-enteroider opretholdt korrekt epitelpolaritet, indeholdt alle tarmcelletyper, opretholdt tarmepitelbarrieren og tillod adgang til den apikale overflade5. Ved hjælp af AO-enteroider som NEC-model opnås en fysiologisk reproduktion af sygdomsprocessen og undersøgelse af værtspatogeninteraktioner.
En stor bidragyder til patofysiologien af NEC er øget tarmpermeabilitet6. Flere molekyler er blevet foreslået som en måde at teste for tarmpermeabilitet in vitro7. Blandt disse er lucifer gul (LY) et hydrofilt farvestof med excitations- og emissionstoppe ved henholdsvis428 nm og 540 nm 8. Da det krydser gennem alle de store paracellulære veje, er det blevet brugt til at evaluere paracellulær permeabilitet i forskellige applikationer, herunder blod-hjerne og tarmepitelbarrierer 8,9. Den traditionelle anvendelse af LY bruger celler dyrket i monolag på en semipermeabel overflade10. LY påføres den apikale overflade og krydser gennem paracellulære tætte krydsproteiner for at samles på den basolaterale side. Højere LY-koncentrationer i det basolaterale rum indikerer nedsat tæt forbindelsesproteiner med efterfølgende nedbrydning af tarmepitelcellebarrieren og øget permeabilitet10. Det er også blevet beskrevet i 3D BO enteroidmodeller, hvor LY blev tilføjet til medierne, og individuelle enteroider blev afbildet til optagelse af LY i lumen11. Selvom dette giver mulighed for kvalitativ analyse via visualisering af LY-optagelse, er kvantitativ analyse begrænset. Denne protokol skitserer en unik teknik, der bruger LY til at vurdere paracellulær permeabilitet ved hjælp af en in vitro NEC enteroidmodel i AO-enteroider, samtidig med at 3D-orienteringen opretholdes. Denne metode kan bruges til både kvalitativ og kvantitativ analyse af permeabilitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarmpermeabilitet er kompleks og afspejler epitelbarrierefunktion. Tarmbarrieren består af et enkelt lag af epitelceller, der formidler transcellulær og paracellulær transport14. Paracellulær permeabilitet er afhængig af tætte krydsproteiner, der forsegler mellemrummet mellem epitelceller14. Inden for denne paracellulære transport er der tre forskellige veje, hvormed molekyler kan krydse: pore, lækage og ubegrænset15. Porevejen giver mulighe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Ashley Nelson fra University of Rochester Medical Center for hendes instrumentale hjælp med vores enteroidmodel. Vi vil også gerne takke Division of Pediatric Surgery ved University of Oklahoma for deres støtte til dette projekt. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health [NIH Grant R03 DK117216-01A1], Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research og Presbyterian Health Foundation Grant #20180587 tildelt Department of Surgery ved University of Oklahoma Health Sciences Center.
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
