एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल में लूसिफर पीले रंग का उपयोग करके आंतों की पारगम्यता का निर्धारण करना
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक विधि को रेखांकित करता है जो आंतों की पारगम्यता निर्धारित करने के लिए एपिकल-आउट एंटरॉइड मॉडल में लूसिफर पीले रंग का उपयोग करता है। इस विधि का उपयोग एंटरोइड्स में पैरासेलुलर पारगम्यता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जो सूजन आंत्र रोगों जैसे नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस को मॉडल करते हैं।
Abstract
एंटरोइड्स सूजन आंत्र रोगों जैसे नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी) के अध्ययन में एक उभरता हुआ शोध उपकरण है। वे पारंपरिक रूप से बेसोलेटरल-आउट (बीओ) रचना में उगाए जाते हैं, जहां उपकला कोशिका की एपिकल सतह आंतरिक लुमेन का सामना करती है। इस मॉडल में, उपचार और प्रयोग के लिए एंटरोइड्स की ल्यूमिनल सतह तक पहुंच चुनौतीपूर्ण है, जो मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने की क्षमता को सीमित करती है। इसे दरकिनार करने के लिए, नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस के लिए एक नवजात एपिकल-आउट (एओ) मॉडल बनाया गया था। चूंकि आंतों के उपकला कोशिका पारगम्यता परिवर्तन एनईसी के लिए पैथोग्नोमोनिक हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल पैरासेलुलर पारगम्यता के मार्कर के रूप में लूसिफर पीले (एलवाई) का उपयोग करता है। एलवाई सभी तीन प्रमुख पैरासेलुलर मार्गों के माध्यम से आंतों के उपकला अवरोध को पार करता है: छिद्र, रिसाव और अप्रतिबंधित। एओ मॉडल में एलवाई का उपयोग एनईसी में पारगम्यता के व्यापक अध्ययन की अनुमति देता है। आईआरबी अनुमोदन और माता-पिता की सहमति के बाद, मानव अपरिपक्व नवजात शिशुओं से आंतों के ऊतकों के सर्जिकल नमूने एकत्र किए गए थे। आंतों की स्टेम कोशिकाओं को क्रिप्ट अलगाव के माध्यम से काटा गया था और एंटरोइड्स को विकसित करने के लिए उपयोग किया गया था। एंटरोइड्स को परिपक्वता के लिए उगाया गया और फिर एओ को बदल दिया गया या बीओ रचना में छोड़ दिया गया। इनका या तो इलाज (नियंत्रण) नहीं किया गया था या लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के साथ इलाज किया गया था और इन विट्रो एनईसी के प्रेरण के लिए हाइपोक्सिक स्थितियों के अधीन किया गया था। पारगम्यता का आकलन करने के लिए एलवाई का उपयोग किया गया था। एपिकल प्रोटीन ज़ोनुला ऑक्लुडेन्स -1 और बेसोलेटरल प्रोटीन β-कैटेनिन के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग ने एओ अनुरूपता की पुष्टि की। एलपीएस और हाइपोक्सिया के साथ इलाज किए गए एओ और बीओ एंटरोइड्स दोनों ने नियंत्रण की तुलना में पैरासेलुलर पारगम्यता में काफी वृद्धि का प्रदर्शन किया। एओ और बीओ एंटरोइड्स दोनों ने नियंत्रण की तुलना में इलाज किए गए एंटरोइड्स के लुमेन में एलवाई के तेज में वृद्धि दिखाई। एओ एंटरॉइड मॉडल में एलवाई का उपयोग पैरासेल्युलर पारगम्यता के सभी तीन प्रमुख मार्गों की जांच के लिए अनुमति देता है। यह मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की जांच के लिए अतिरिक्त रूप से अनुमति देता है और यह बीओ एंटरॉइड मॉडल की तुलना में पारगम्यता को कैसे प्रभावित कर सकता है।
Introduction
एंटरोइड्स अंग-प्रतिबंधित मानव आंतों के स्टेम सेल 1,2 से प्राप्त त्रि-आयामी (3 डी) संरचनाएं हैं। वे पूरी तरह से उपकला वंश से बने होते हैं और इसमें सभी विभेदित आंतों के उपकला कोशिका प्रकारहोते हैं। एंटरोइड्स एक एपिकल ल्यूमिनल सतह से बने सेलुलर ध्रुवीयता को भी बनाए रखते हैं जो एक आंतरिक डिब्बे और आसपास के मीडिया के सामने एक बेसोलेटरल सतह बनाते हैं। एंटरोइड्स एक अद्वितीय मॉडल है जिसमें वे मेजबान की विशेषताओं को संरक्षित करते हैं जिससेवे उत्पन्न हुए थे। इस प्रकार, समय से पहले मानव शिशुओं से उत्पन्न एंटरोइडएक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं जो मुख्य रूप से इस आबादी को प्रभावित करने वाली बीमारियों की जांच के लिए उपयोगी है, जैसे कि नेक्रोटाइज़िंग एंटरोकोलाइटिस (एनईसी)।
पारंपरिक एंटरॉइड मॉडल को बेसोलेटरल-आउट (बीओ) रचना में उगाया जाता है, जहां एंटरोइड को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम) के गुंबद में घेर लिया जाता है। बीएमएम एंटरॉइड को बाहर की ओर बेसोलेटरल सतह के साथ 3 डी संरचना बनाए रखने के लिए प्रेरित करता है। बीओ एंटरोइड्स एनईसी के लिए एक उपयुक्त मॉडल है जो दो आयामी (2 डी) प्राथमिक मानव सेल लाइनों और विवो पशु मॉडल 2,4 के बीच की खाईको पुल करता है। एनईसी को एंटरोइड्स के आसपास के मीडिया में एलपीएस या बैक्टीरिया जैसे रोगजनकों को रखकर एंटरोइड्स में प्रेरित किया जाता है, इसके बाद हाइपोक्सिक स्थितियों 2,3 के संपर्क में आता है। बीओ एंटरॉइड एनईसी मॉडल के साथ चुनौती यह है कि यह मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के प्रभावी अध्ययन की अनुमति नहीं देता है, जो विवो में एपिकल सतह पर होता है। आंतों की पारगम्यता में परिवर्तन इन मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के कारण होते हैं। बेहतर ढंग से समझने के लिए कि पारगम्यता रोग के पैथोफिजियोलॉजिकल आधार को कैसे प्रभावित करती है, एक मॉडल बनाया जाना चाहिए जिसमें एपिकल सतह का इलाज शामिल है।
को एट अल यह प्रदर्शित करने वाले पहले व्यक्ति थे कि परिपक्व बीओ एंटरोइड्स को बीएमएम गुंबदों को हटाकर और उन्हें मीडिया5 में पुन: निलंबित करके एक एपिकल-आउट (एओ) रचना बनाने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इस लेख से पता चला है कि एओ एंटरोइड्स ने सही उपकला ध्रुवीयता बनाए रखी, जिसमें सभी आंतों के सेल प्रकार शामिल थे, आंतों के उपकला अवरोध को बरकरार रखा, और एपिकल सतह5 तक पहुंच की अनुमति दी। एनईसी मॉडल के रूप में एओ एंटरोइड्स का उपयोग रोग प्रक्रिया के शारीरिक प्रजनन और मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के अध्ययन को प्राप्त करता है।
एनईसी के पैथोफिज़ियोलॉजी में एक प्रमुख योगदानकर्ता आंतों की पारगम्यतामें वृद्धि है। विट्रो 7 में आंतों की पारगम्यता के परीक्षण के तरीके के रूप में कई अणुओं को प्रस्तावित किया गया है। इनमें से, लूसिफर पीला (एलवाई)क्रमशः 428 एनएम और 540 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन शिखर के साथ एक हाइड्रोफिलिक डाई है। जैसा कि यह सभी प्रमुख पैरासेलुलर मार्गों के माध्यम से पार करता है, इसका उपयोग रक्त-मस्तिष्क और आंतों के उपकलाअवरोधों सहित विभिन्न अनुप्रयोगों में पैरासेलुलर पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है। एलवाई का पारंपरिक अनुप्रयोग अर्ध-पारगम्य सतह10 पर मोनोलेयर में उगाई गई कोशिकाओं का उपयोग करता है। एलवाई को एपिकल सतह पर लागू किया जाता है और बेसोलेटरल साइड पर इकट्ठा होने के लिए पैरासेल्युलर तंग जंक्शन प्रोटीन के माध्यम से पार करता है। बेसोलेटरल डिब्बे में उच्च एलवाई सांद्रता बाद में आंतों के उपकला कोशिका अवरोध टूटने और बढ़ी हुई पारगम्यता10 के साथ तंग जंक्शन प्रोटीन में कमी का संकेत देती है। इसे 3 डी बीओ एंटरॉइड मॉडल में भी वर्णित किया गया है जहां एलवाई को मीडिया में जोड़ा गया था और लुमेन11 में एलवाई के उत्थान के लिए व्यक्तिगत एंटरोइड्स को चित्रित किया गया था। यद्यपि यह एलवाई अपटेक के विज़ुअलाइज़ेशन के माध्यम से गुणात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है, मात्रात्मक विश्लेषण सीमित है। यह प्रोटोकॉल एक अनूठी तकनीक को रेखांकित करता है जो 3 डी अभिविन्यास को बनाए रखते हुए एओ एंटरोइड्स में इन विट्रो एनईसी एंटरॉइड मॉडल का उपयोग करके पैरासेल्युलर पारगम्यता का आकलन करने के लिए एलवाई का उपयोग करता है। इस विधि का उपयोग पारगम्यता के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आंतों की पारगम्यता उपकला बाधा समारोह का जटिल और प्रतिबिंबित है। आंतों की बाधा में उपकला कोशिकाओं की एक एकल परत शामिल होती है जो ट्रांससेलुलर और पैरासेलुलर परिवहन की मध्यस्थता करतीहै। पैरास?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रोचेस्टर मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय से एशले नेल्सन को हमारे एंटरॉइड मॉडल के साथ उनकी सहायक मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इस परियोजना के समर्थन के लिए ओकलाहोमा विश्वविद्यालय में बाल चिकित्सा सर्जरी विभाग को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ [एनआईएच ग्रांट आर 03 डीके 117216-01 ए 1], ओक्लाहोमा सेंटर फॉर एडल्ट स्टेम सेल रिसर्च, और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन ग्रांट # 20180587 द्वारा ओक्लाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में सर्जरी विभाग को सम्मानित किया गया था।
Materials
| [leu] 15-gastrin 1 | Millipore Sigma | G9145-.1MG | |
| 100 µm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 100% LWRN conditioned media | Made in-house following Miyoshi et al.12 | ||
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3526 | |
| 96-well black, clear bottom plate | Greiner Bio-One | 655090 | |
| A-83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11034 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse secondary ab, 1:1000 | Invitrogen | A-11032 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Anti-zonula occludens-1 rabbit primary ab, 1:200 | Cell Signaling | #D6L1E | |
| Anti-β-catenin mouse primary ab, 1:100 | Cell Signaling | #14-2567-82 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Barrier PAP pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| BMM (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
| Dissecting scissors | |||
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11-965-118 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14-190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore Sigma | GF144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | EDS-500G | |
| EVOS m7000 Imaging system | Invitrogen | AMF7000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-525 | |
| Fluoroshield with DAPI | Millipore Sigma | F6057-20mL | |
| Forceps | |||
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15-750-060 | |
| Glass coverslips | |||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Millipore Sigma | L2630-25MG | |
| Lucifer Yellow CH, Lithium Salt | Invitrogen | L453 | |
| Modular incubator chamber | Billups Rothenberg Inc. | MIC101 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Millipore Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-148 | |
| Refrigerated swinging bucket centrifuge | |||
| Refrigerated tabletop microcentrifuge | |||
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| SB202190 | Millipore Sigma | S7067-5MG | |
| SpectraMax iD3 microplate reader | Molecular devices | ||
| Tube Revolver Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| Ultra-low attachment 24-well tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| Y-27632, ROCK inhibitor (RI) | Tocris | 1254 |
References
- Ranganathan, S., Smith, E. M., Foulke-Abel, J. D., Barry, E. M. Research in a time of enteroids and organoids: How the human gut model has transformed the study of enteric bacterial pathogens. Gut Microbes. 12 (1), 1795492 (2020).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
- Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
- Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
- Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. The American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
- Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time measurement of epithelial barrier permeability in human intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (130), e56960 (2017).
- Lian, P., Braber, S., Varasteh, S., Wichers, H. J., Folkerts, G. Hypoxia and heat stress affect epithelial integrity in a Caco-2/HT-29 co-culture. Scientific Reports. 11, 13186 (2021).
- Zhao, W., Han, L., Bae, Y., Manickam, D. S. Lucifer yellow – A robust paracellular permeability marker in a cell model of the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (150), e58900 (2019).
- Manabe, A., et al. Chlorpheniramine increases paracellular permeability to marker fluorescein lucifer yellow mediated by internalization of occludin in murine colonic epithelial cells. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 40 (8), 1299-1305 (2017).
- Bardenbacher, M., et al. Permeability analyses and three dimensional imaging of interferon gamma-induced barrier disintegration in intestinal organoids. Stem Cell Research. 35, 101383 (2019).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Buonpane, C., et al. Experimental modeling of necrotizing enterocolitis in human infant intestinal enteroids. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 111-118 (2022).
- Chanez-Paredes, S. D., Abtahi, S., Kuo, W. -. T., Turner, J. R. Differentiating between tight junction-dependent and tight junction-independent intestinal barrier loss in vivo. Methods in Molecular Biology. 2367, 249-271 (2021).
- Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo. Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).
- Monaco, A., Ovryn, B., Axis, J., Amsler, K. The epithelial cell leak pathway. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7677 (2021).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8, 2871 (2018).
- Stroulios, G., et al. Culture methods to study apical-specific interactions using intestinal organoid models. Journal of Visualized Experiments. (169), e62330 (2021).
- Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
