ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用
Summary
ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro モデルとして浮上しています。ここでは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理機能を測定するためのプロトコルについて詳しく説明します。
Abstract
薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です。したがって、適切な前臨床心臓安全性評価モデルを使用することは、医薬品開発中の重要なステップです。現在、心臓の安全性評価は依然として動物実験に大きく依存しています。しかし、動物モデルは、特に心臓の電気生理学的特性の点で、種固有の違いのために、ヒトに対する翻訳特異性が低いことに悩まされています。したがって、前臨床心臓安全性評価のための信頼性が高く、効率的で、人間ベースのモデルを開発することが急務です。ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための貴重な in vitro モデルとして浮上しています。hiPSC-CMは、多様な遺伝的背景やさまざまな病状を持つ個人から取得できるため、薬物誘発性心毒性を個別に評価するための理想的な代理となります。そのため、hiPSC-CMの機能特性を網羅的に調べるための方法論を確立する必要があります。このプロトコルでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム処理の測定など、hiPSC-CMで評価できるさまざまな機能アッセイについて詳しく説明します。全体として、前臨床心臓安全性評価にhiPSC-CMを組み込むことは、医薬品開発に革命をもたらす可能性を秘めています。
Introduction
医薬品開発は長くて費用のかかるプロセスです。2009年から2018年の間に米国食品医薬品局(FDA)によって承認された新しい治療薬の研究では、資本化された研究および臨床試験の推定中央値は製品あたり9億8500万ドルであると報告されています1。薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です2。特に、心毒性は治療薬の複数のクラスの間で報告されています3。したがって、心臓の安全性評価は、医薬品開発プロセスにおける重要な要素です。心臓の安全性評価の現在のパラダイムは、依然として動物モデルに大きく依存しています。しかし、動物モデルの使用との種の違いは、ヒト患者における薬物誘発性心毒性の不正確な予測の主な原因としてますます認識されています4。例えば、心臓活動電位の形態は、異なる再分極電流からの寄与のために、ヒトとマウスの間で実質的に異なる5。さらに、心臓生理学に影響を与える可能性のある心筋ミオシンおよび環状RNAの差次的アイソフォームは、種の間で十分に文書化されています6,7。これらのギャップを埋めるには、前臨床心臓の安全性評価のための信頼性が高く、効率的な、人間ベースのモデルを確立することが不可欠です。
人工多能性幹細胞(iPSC)技術の画期的な発明は、前例のない薬物スクリーニングおよび疾患モデリングプラットフォームを生み出しました。過去10年間で、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)を作製する方法は十分に確立されている8,9。hiPSC-CMは、疾患モデリング、薬物誘発性心毒性スクリーニング、および精密医療における潜在的な用途に大きな関心を集めています。例えば、hiPSC-CMは、QT延長症候群10、肥大型心筋症11,12、拡張型心筋症13,14,15などの遺伝的遺伝によって引き起こされる心疾患の病理学的表現型をモデル化するために利用されてきた。その結果、心疾患の病因に関与する重要なシグナル伝達経路が特定され、効果的な治療のための潜在的な治療戦略に光を当てることができます。さらに、hiPSC-CMは、ドキソルビシン、トラスツズマブ、およびチロシンキナーゼ阻害剤を含む抗癌剤に関連する薬物誘発性心毒性をスクリーニングするために使用されています16,17,18;結果として生じる心毒性を軽減するための戦略は調査中です。.最後に、hiPSC-CMに保持される遺伝情報は、個人レベルと集団レベルの両方で薬物誘発性心毒性のスクリーニングと予測を可能にします19,20。まとめると、hiPSC-CMは、パーソナライズされた心臓の安全性予測のための非常に貴重なツールであることが証明されています。
このプロトコルの全体的な目標は、hiPSC-CMを疾患モデリング、薬物誘発性心毒性スクリーニング、および精密医療に適用する上で非常に重要なhiPSC-CMの機能特性を包括的かつ効率的に調査するための方法論を確立することです。ここでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム(Ca2+)ハンドリングの測定など、hiPSC-CMの機能特性を評価するための一連の機能アッセイについて詳しく説明します(図1)。
Protocol
1.培地と溶液の準備 50x B27サプリメントの10 mLボトルと500 mLのRPMI 1640培地を混合して、hiPSC-CM維持培地を調製します。培地を4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。使用前に培地を室温(RT)に平衡化してください。 20 mLの血清置換培地と180 mLのhiPSC-CM維持培地(10%希釈、v/v)を混合して、hiPSC-CMシーディング培地を調製します。新たに調製した播種培地が好ましいが?…
Representative Results
このプロトコルでは、hiPSC-CMの収縮運動、電界電位、活動電位、およびCa2+ 過渡現象の測定方法について説明します。酵素消化、細胞播種、維持、および機能アッセイ伝導を含む概略図を 図1に示します。収縮運動測定にはhiPSC-CM単分子膜の形成が必要です(図2B)。hiPSC-CMの収縮-緩和運動の代表的な痕跡を 図2Cに示しま?…
Discussion
ヒトiPS細胞技術は、疾患モデリングと薬物スクリーニングのための強力なプラットフォームとして登場しました。ここでは、hiPSC-CMの収縮性、電界電位、活動電位、およびCa2+過渡現象を測定するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理学の包括的な特性評価を提供します。これらの機能アッセイは、我々のグループ12、<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
原稿を校正してくれたブレイク・ウーに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)R01 HL113006、R01 HL141371、R01 HL163680、R01 HL141851、U01FD005978、NASA NNX16A069A(JCW)、およびAHAポスドクフェローシップ872244(GMP)の支援を受けました。
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
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Cite This Article
Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).