Summary

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Abstract

A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.

Introduction

O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto1. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado2. Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas3. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. O paradigma atual para a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de modelos animais. No entanto, as diferenças de espécies em relação ao uso de modelos animais são cada vez mais reconhecidas como a principal causa de previsões imprecisas para a cardiotoxicidade induzida por drogas em pacientes humanos4. Por exemplo, a morfologia do potencial de ação cardíaca difere substancialmente entre humanos e camundongos devido às contribuições de diferentes correntes de repolarização5. Além disso, isoformas diferenciais de miosina cardíaca e RNAs circulares que podem afetar a fisiologia cardíaca têm sido bem documentadas entre as espécies 6,7. Para preencher essas lacunas, é imperativo estabelecer um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca.

A invenção inovadora da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) gerou plataformas sem precedentes de triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Na última década, métodos para gerar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) tornaram-se bem estabelecidos 8,9. Os CM-hiPSC têm atraído grande interesse em suas potenciais aplicações na modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Por exemplo, os CM-hiPSC têm sido utilizados para modelar os fenótipos patológicos de doenças cardíacas causadas por herança genética, como a síndrome do QT longo10, a cardiomiopatia hipertrófica 11,12 e a cardiomiopatia dilatada13,14,15. Consequentemente, foram identificadas as principais vias de sinalização implicadas na patogênese das doenças cardíacas, o que pode lançar luz sobre possíveis estratégias terapêuticas para um tratamento eficaz. Além disso, os CM-hiPSC têm sido utilizados para rastrear a cardiotoxicidade induzida por drogas associada a agentes anticancerígenos, incluindo doxorrubicina, trastuzumabe e inibidores da tirosina quinase16,17,18; estratégias para mitigar a cardiotoxicidade resultante estão sob investigação. Por fim, a informação genética retida nas CME-hiPSC permite a triagem e a predição da cardiotoxicidade induzida por fármacos tanto em nível individual quanto populacional19,20. Coletivamente, os hiPSC-CMs provaram ser uma ferramenta inestimável para a previsão personalizada da segurança cardíaca.

O objetivo geral deste protocolo é estabelecer metodologias para investigar de forma abrangente e eficiente as características funcionais dos CM-hiPSC, que são de grande importância na aplicação de CMhiPSC para modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Aqui, detalhamos uma série de ensaios funcionais para avaliar as propriedades funcionais dos CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio (Ca2+) (Figura 1).

Protocol

1. Preparação de meios e soluções Prepare o meio de manutenção hiPSC-CM misturando um frasco de 10 mL de suplemento de 50x B27 e 500 mL de meio RPMI 1640. Conservar o meio a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês. Equilibre a temperatura média a temperatura ambiente (RT) antes de usar. Preparar o meio de semeadura hiPSC-CM misturando 20 mL de reposição sérica e 180 mL de meio de manutenção hiPSC-CM (diluição a 10%, v/v). Embora o meio de semeadura recém-preparado seja …

Representative Results

Este protocolo descreve como medir o movimento de contração, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+ de CM-hiPSC. Um diagrama esquemático incluindo a digestão enzimática, a semeadura celular, a manutenção e a condução do ensaio funcional é mostrado na Figura 1. A formação da monocamada hiPSC-CM é necessária para a medição do movimento de contração (Figura 2B). Um traço representativo do movimento de contraç?…

Discussion

A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Blake Wu pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW), e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

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Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

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