JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Published: August 04, 2022
doi:
10.3791/64265
, , , ,
1Stanford Cardiovascular Institute,Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine,Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology,Stanford University School of Medicine

Summary

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM’lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

Abstract

İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir. Bu nedenle, uygun preklinik kardiyak güvenlik değerlendirme modellerinin kullanılması, ilaç geliştirme sırasında kritik bir adımdır. Şu anda, kardiyak güvenlik değerlendirmesi hala hayvan çalışmalarına büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modelleri, özellikle kardiyak elektrofizyolojik özellikler açısından, türe özgü farklılıklar nedeniyle, insanlara zayıf translasyonel özgüllükten muzdariptir. Bu nedenle, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için paha biçilmez bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. hiPSC-CM’ler, farklı genetik geçmişlere ve çeşitli hastalıklı koşullara sahip bireylerden elde edilebilir, bu da onları ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi ayrı ayrı değerlendirmek için ideal bir vekil haline getirir. Bu nedenle, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturulmalıdır. Bu protokolde, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum işleme ölçümü de dahil olmak üzere hiPSC-CM’ler üzerinde değerlendirilebilecek çeşitli fonksiyonel testleri detaylandırıyoruz. Genel olarak, hiPSC-CM’lerin klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesine dahil edilmesi, ilaç geliştirmede devrim yaratma potansiyeline sahiptir.

Introduction

İlaç geliştirme uzun ve pahalı bir süreçtir. 2009 ve 2018 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan yeni terapötik ilaçların bir çalışması, kapitalize edilmiş araştırma ve klinik çalışmaların tahmini medyan maliyetinin ürün başına 985 milyon dolar olduğunu bildirmiştir1. İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir2. Özellikle, kardiyotoksisite birden fazla terapötik ilaç sınıfı arasında bildirilmiştir3. Bu nedenle, kardiyak güvenlik değerlendirmesi, ilaç geliştirme sürecinde çok önemli bir bileşendir. Kardiyak güvenlik değerlendirmesi için mevcut paradigma hala hayvan modellerine büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modellerinin kullanımından kaynaklanan tür farklılıkları, insan hastalarında ilaca bağlı kardiyotoksisite için yanlış tahminlerin birincil nedeni olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir4. Örneğin, kardiyak aksiyon potansiyelinin morfolojisi, farklı repolarize akımların katkıları nedeniyle insanlar ve fareler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir5. Ek olarak, kardiyak miyozin ve dairesel RNA’ların kardiyak fizyolojiyi etkileyebilecek diferansiyel izoformları,türler arasında iyi belgelenmiştir 6,7. Bu boşlukları kapatmak için, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model oluşturmak zorunludur.

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin çığır açan icadı, benzeri görülmemiş ilaç tarama ve hastalık modelleme platformları oluşturmuştur. Son on yılda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler) üretme yöntemleri iyi kurulmuş 8,9 haline gelmiştir. hiPSC-CM’ler, hastalık modelleme, ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hassas tıptaki potansiyel uygulamalarına büyük ilgi duymuştur. Örneğin, uzun QT sendromu 10, hipertrofik kardiyomiyopati 11,12 ve dilate kardiyomiyopati 13,14,15 gibi genetik kalıtımın neden olduğu kalp hastalıklarının patolojik fenotiplerini modellemek için hiPSC-CM’ler kullanılmıştır. Sonuç olarak, kalp hastalıklarının patogenezinde rol oynayan ve etkili tedavi için potansiyel terapötik stratejilere ışık tutabilecek anahtar sinyal yolları tanımlanmıştır. Ayrıca, hiPSC-CM’ler, doksorubisin, trastuzumab ve tirozin kinaz inhibitörleri16,17,18 dahil olmak üzere antikanser ajanlarla ilişkili ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi taramak için kullanılmıştır; Ortaya çıkan kardiyotoksisiteyi hafifletmek için stratejiler araştırılmaktadır. Son olarak, hiPSC-CM’lerde tutulan genetik bilgi, ilaca bağlı kardiyotoksisitenin hem bireysel hem de popülasyon seviyelerindetaranmasına ve tahmin edilmesine izin verir 19,20. Toplu olarak, hiPSC-CM’lerin kişiselleştirilmiş kardiyak güvenlik tahmini için paha biçilmez bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

Bu protokolün genel amacı, hiPSC-CM’lerin hastalık modellemesine, ilaca bağlı kardiyotoksisite taramasına ve hassas tıbba uygulanmasında büyük önem taşıyan hiPSC-CM’lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı ve verimli bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturmaktır. Burada, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum (Ca2+) kullanımının ölçümü de dahil olmak üzere bir dizi fonksiyonel tahlili detaylandırıyoruz (Şekil 1).

Protocol

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması 10 mL’lik bir şişe 50x B27 takviyesi ve 500 mL RPMI 1640 ortamını karıştırarak hiPSC-CM bakım ortamını hazırlayın. Ortamı 4 ° C’de saklayın ve bir ay içinde kullanın. Kullanmadan önce ortamdan oda sıcaklığına (RT) dengeleyin. 20 mL serum replasmanı ve 180 mL hiPSC-CM bakım ortamı ( seyreltme, v/v) karıştırarak hiPSC-CM tohumlama ortamı hazırlayın. Taze hazırlanmış tohumlama ortamı tercih edilirken, 4 ° C’…

Representative Results

Bu protokol, hiPSC-CM’lerin büzülme hareketinin, alan potansiyelinin, aksiyon potansiyelinin ve Ca2+ geçiciliğinin nasıl ölçüleceğini açıklar. Enzimatik sindirim, hücre tohumlaması, bakım ve fonksiyonel tahlil iletimini içeren şematik bir diyagram Şekil 1’de gösterilmiştir. HiPSC-CM tek katmanının oluşumu, büzülme hareketi ölçümü için gereklidir (Şekil 2B). HiPSC-CM’lerin büzülme-gevşeme hareketinin temsili bir izi <st…

Discussion

İnsan iPSC teknolojisi, hastalık modelleme ve ilaç taraması için güçlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM kontraktilitesini, alan potansiyelini, aksiyon potansiyelini ve Ca2 + geçicisini ölçmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hiPSC-CM kontraktilitesinin ve elektrofizyolojisinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bu fonksiyonel testler grubumuzun 12,13,18,24,25,26,27…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Blake Wu’ya el yazmasını düzelttiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 ve NASA NNX16A069A (JCW) ve AHA Doktora Sonrası Burs 872244 (GMP) tarafından desteklenmiştir.

Materials

35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C., Gamper, N. . Ion Channels: Methods and Protocols. , 171-187 (2013).

Tags

Human IPSC-derived CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentPre-clinical EvaluationMicroelectrode ArrayPatch ClampDisease ModelingDrug-induced Cardiotoxicity ScreeningPrecision MedicineCell CultureExtracellular MatrixCell SeedingSpontaneous Beating
check_url/64265?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image