Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en lovende in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. Her beskriver vi en protokoll for måling av kontraktilitet og elektrofysiologi av hiPSC-CM.
Narkotika-indusert kardiotoksisitet er den ledende årsaken til narkotika slitasje og tilbaketrekking fra markedet. Bruk av egnede prekliniske evalueringsmodeller for hjertesikkerhet er derfor et kritisk skritt under legemiddelutvikling. For tiden er hjertesikkerhetsvurdering fortsatt svært avhengig av dyreforsøk. Dyremodeller er imidlertid plaget av dårlig translasjonsspesifisitet for mennesker på grunn av artsspesifikke forskjeller, spesielt når det gjelder hjerteelektrofysiologiske egenskaper. Det er derfor et presserende behov for å utvikle en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering. Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en uvurderlig in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. hiPSC-CM kan fås fra personer med ulik genetisk bakgrunn og ulike syke tilstander, noe som gjør dem til et ideelt surrogat for å vurdere legemiddelindusert kardiotoksisitet individuelt. Derfor må metoder for å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM etableres. I denne protokollen beskriver vi ulike funksjonelle analyser som kan vurderes på hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering. Samlet sett har inkorporering av hiPSC-CM i preklinisk hjertesikkerhetsvurdering potensial til å revolusjonere legemiddelutvikling.
Narkotikautvikling er en lang og kostbar prosess. En studie av nye terapeutiske legemidler godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) mellom 2009 og 2018 rapporterte at den estimerte mediankostnaden for kapitalisert forskning og kliniske studier var $ 985 millioner per produkt1. Legemiddelindusert kardiotoksisitet er den viktigste årsaken til legemiddelslitasje og tilbaketrekning fra markedet2. Spesielt er kardiotoksisitet rapportert blant flere klasser av terapeutiske legemidler3. Derfor er hjertesikkerhetsvurdering en avgjørende komponent i legemiddelutviklingsprosessen. Det nåværende paradigmet for hjertesikkerhetsvurdering er fortsatt svært avhengig av dyremodeller. Imidlertid blir artsforskjeller fra bruk av dyremodeller i økende grad anerkjent som en primær årsak til unøyaktige spådommer for legemiddelindusert kardiotoksisitet hos mennesker4. For eksempel varierer morfologien til hjertets handlingspotensial vesentlig mellom mennesker og mus på grunn av bidragene fra forskjellige repolariserende strømmer5. I tillegg er differensialisoformer av hjertemyosin og sirkulære RNA som kan påvirke hjertefysiologien godt dokumentert blant art 6,7. For å bygge bro over disse hullene er det viktig å etablere en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering.
Den banebrytende oppfinnelsen av indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har generert enestående narkotikascreening og sykdomsmodelleringsplattformer. I løpet av det siste tiåret har metoder for å generere menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) blitt godt etablert 8,9. hiPSC-CMs har tiltrukket seg stor interesse for deres potensielle anvendelser i sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. For eksempel har hiPSC-CM blitt brukt til å modellere de patologiske fenotypene av hjertesykdommer forårsaket av genetisk arv, for eksempel lang QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilatert kardiomyopati13,14,15. Følgelig har viktige signalveier involvert i patogenesen av hjertesykdommer blitt identifisert, noe som kan kaste lys over potensielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Videre har hiPSC-CM blitt brukt til å screene legemiddelindusert kardiotoksisitet assosiert med kreftmidler, inkludert doksorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehemmere16,17,18; Strategier for å redusere den resulterende kardiotoksisiteten er under utredning. Endelig tillater den genetiske informasjonen som beholdes i hiPSC-CMs screening og prediksjon av legemiddelindusert kardiotoksisitet på både individ- og populasjonsnivå19,20. Samlet har hiPSC-CMs vist seg å være et uvurderlig verktøy for personlig hjertesikkerhetsprediksjon.
Det overordnede målet med denne protokollen er å etablere metoder for omfattende og effektivt å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, som er av stor betydning for å anvende hiPSC-CM mot sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. Her beskriver vi en rekke funksjonelle analyser for å vurdere de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering (Ca2+) (figur 1).
Human iPSC-teknologi har dukket opp som en kraftig plattform for sykdomsmodellering og narkotikascreening. Her beskriver vi en detaljert protokoll for måling av hiPSC-CM kontraktilitet, feltpotensial, aksjonspotensial og Ca2+ transient. Denne protokollen gir en omfattende karakterisering av hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funksjonelle analysene har blitt brukt i flere publikasjoner fra vår gruppe 12,13,18,24,25,26,27.<su…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Blake Wu for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, og NASA NNX16A069A (JCW), og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
NIS Elements AR | |||
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |