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Developmental Biology

Purification des polysomes à partir de nodules symbiotiques de soja

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64269
, , , , , ,
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía,Universidad de la República, 2Departamento de Genómica,Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology,University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias,Universidad de la República

Summary

Ce protocole décrit une méthode de purification eucaryote des polysomes à partir de nodules de soja intacts. Après le séquençage, des pipelines standard pour l’analyse de l’expression génique peuvent être utilisés pour identifier les gènes exprimés différentiellement aux niveaux du transcriptome et du translatome.

Abstract

L’objectif de ce protocole est de fournir une stratégie pour étudier le translatome eucaryote du nodule symbiotique du soja (Glycine max). Cet article décrit des méthodes optimisées pour isoler les polyribosomes dérivés de plantes et leurs ARNm associés à analyser à l’aide du séquençage de l’ARN. Premièrement, les lysats cytoplasmiques sont obtenus par homogénéisation dans des conditions de préservation des polysomes et de l’ARN à partir de nodules de soja entiers congelés. Ensuite, les lysats sont éliminés par centrifugation à basse vitesse, et 15% du surnageant est utilisé pour l’isolement de l’ARN total (TOTAL). Le lysat éliminé restant est utilisé pour isoler les polysomes par ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose à deux couches (12% et 33,5%). L’ARNm associé aux polysomes (PAR) est purifié à partir de pastilles polysomiques après remise en suspension. TOTAL et PAR sont évalués par électrophorèse capillaire très sensible pour répondre aux normes de qualité des bibliothèques de séquençage pour le séquençage de l’ARN-seq. À titre d’exemple d’application en aval, après séquençage, des pipelines standard pour l’analyse de l’expression génique peuvent être utilisés pour obtenir des gènes exprimés différentiellement aux niveaux du transcriptome et du translatome. En résumé, cette méthode, en combinaison avec le séquençage de l’ARN, permet l’étude de la régulation translationnelle des ARNm eucaryotes dans un tissu complexe tel que le nodule symbiotique.

Introduction

Les légumineuses, comme le soja (Glycine max), peuvent établir une symbiose avec des bactéries spécifiques du sol appelées rhizobiums. Cette relation mutualiste provoque la formation de nouveaux organes, les nodules symbiotiques, sur les racines des plantes. Les nodules sont les organes végétaux hébergeant la bactérie et sont constitués de cellules hôtes dont le cytoplasme est colonisé par une forme spécialisée de rhizobiums appelée bactéroïdes. Ces bactéroïdes catalysent la réduction de l’azote atmosphérique (N2) en ammoniac, qui est transféré à la plante en échange de glucides 1,2.

Bien que cette symbiose fixatrice d’azote soit l’une des symbioses plantes-microbes les mieux étudiées, de nombreux aspects restent à mieux comprendre, tels que la façon dont les plantes soumises à différentes conditions de stress abiotique modulent leur interaction avec leur partenaire symbiotique et comment cela affecte le métabolisme des nodules. Ces processus pourraient être mieux compris en analysant le translatome nodule (c’est-à-dire le sous-ensemble d’ARN messagers [ARNm] activement traduit). Les polyribosomes ou polysomes sont des complexes de ribosomes multiples associés à l’ARNm, couramment utilisés pour étudier la traduction3. La méthode de profilage des polysomes consiste en l’analyse des ARNm associés aux polysomes et a été utilisée avec succès pour étudier les mécanismes posttranscriptionnels contrôlant l’expression des gènes qui se produisent dans divers processus biologiques 4,5.

Historiquement, l’analyse de l’expression du génome s’est principalement concentrée sur la détermination de l’abondance de l’ARNm 6,7,8,9. Cependant, il y a un manque de corrélation entre les niveaux de transcrits et de protéines en raison des différentes étapes de la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique, en particulier la traduction10,11,12. De plus, aucune dépendance n’a été observée entre les changements au niveau du transcriptome et ceux qui se produisent au niveau du translatome13. L’analyse directe de l’ensemble des ARNm en cours de traduction permet une mesure plus précise et complète de l’expression génique cellulaire (dont le critère d’évaluation est l’abondance des protéines) que celle obtenue lorsque seuls les niveaux d’ARNm sont analysés14,15,16.

Ce protocole décrit comment les polysomes d’origine végétale sont purifiés à partir de nodules de soja intacts par centrifugation différentielle à travers un coussin de saccharose à deux couches (Figure 1). Cependant, comme les ribosomes dérivés de bactéroïdes sont également présents dans les nodules, un mélange d’espèces de ribosomes et d’ARN est purifié, même si les eucaryotes représentent la fraction principale (90%-95%). L’isolement, la quantification et le contrôle de la qualité de l’ARN qui s’ensuivent sont également décrits (figure 1). Ce protocole, en combinaison avec RNA-seq, devrait fournir des résultats expérimentaux sur la régulation translationnelle des ARNm eucaryotes dans un tissu complexe tel que le nodule symbiotique.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu schématique de la méthodologie proposée pour la purification des polysomes eucaryotes à partir de nodules symbiotiques. Le schéma donne un aperçu des étapes suivies dans le protocole depuis (1) la croissance des plantes et (2) la récolte des nodules jusqu’à (3) la préparation des extraits cytosoliques, (3) l’obtention d’échantillons TOTAL et (4) d’échantillons PAR, et (5) l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité. Abréviations : PEB = tampon d’extraction de polysomes; RB = tampon de remise en suspension; TOTAL = ARN total; PAR = ARNm associé aux polysomes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Croissance des plantes et inoculation des rhizobiums Pour générer les nodules requis, semez les graines de soja de votre choix dans le substrat sélectionné dans une chambre de croissance dans des conditions contrôlées.NOTE: Dans ce protocole, les graines ont été semées dans une bouteille en plastique de 0,5 L remplie d’un mélange de sable:vermiculite (1:1). La chambre de croissance a été réglée avec une température du cycle jour/nuit de 28 °C / 20 ° C, respectivement, …

Representative Results

L’évaluation de la quantité et de la qualité des fractions TOTAL et PAR purifiées avec la procédure susmentionnée est essentielle pour déterminer son succès, car pour la plupart des applications en aval, telles que le séquençage de l’ARN, des échantillons de haute qualité sont fondamentaux pour la préparation et le séquençage des bibliothèques. De plus, l’intégrité des molécules d’ARN permet la capture d’un instantané du profil d’expression génique au moment du prélèvement de l’échan…

Discussion

L’étude de la régulation de l’expression génique au niveau translationnel est essentielle pour mieux comprendre les différents processus biologiques puisque le critère d’évaluation de l’expression génique cellulaire est l’abondance des protéines13,14. Ceci peut être évalué en analysant le translatome du tissu ou de l’organisme d’intérêt pour lequel la fraction polysomale doit être purifiée et ses ARNm associés…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par la subvention 282 de la SCCI I+D 2020, la subvention FVF 2017 n° 210 et PEDECIBA (María Martha Sainz).

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207
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References

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Keywords: Polysome PurificationSoybeanSymbiotic NodulesCentrifugationRNA-SeqPolysome Extraction BufferSucrose CushionUltracentrifugationRNA Isolation
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