JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Soya Fasulyesi Simbiyotik Nodüllerinden Polizom Saflaştırma

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64269
, , , , , ,
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía,Universidad de la República, 2Departamento de Genómica,Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology,University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias,Universidad de la República

Summary

Bu protokol, bozulmamış soya fasulyesi nodüllerinden ökaryotik polizom saflaştırma için bir yöntemi açıklar. Dizilemeden sonra, transkriptom ve translatom seviyelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için gen ekspresyon analizi için standart boru hatları kullanılabilir.

Abstract

Bu protokolün amacı, soya fasulyesi (Glycine max) simbiyotik nodülün ökaryotik translatomunu incelemek için bir strateji sağlamaktır. Bu yazıda, RNA dizilimi kullanılarak analiz edilecek bitki kaynaklı poliribozomları ve bunlarla ilişkili mRNA’ları izole etmek için optimize edilmiş yöntemler açıklanmaktadır. İlk olarak, sitoplazmik lizatlar, bütün, dondurulmuş soya fasulyesi nodüllerinden polizom ve RNA koruyucu koşullarda homojenizasyon yoluyla elde edilir. Daha sonra, lizatlar düşük hızlı santrifüjleme ile temizlenir ve süpernatantın% 15’i toplam RNA (TOTAL) izolasyonu için kullanılır. Kalan temizlenmiş lizat, iki katmanlı bir sakkaroz yastığı (% 12 ve% 33.5) aracılığıyla ultrasantrifüjleme yoluyla polizomları izole etmek için kullanılır. Polizom ile ilişkili mRNA (PAR), yeniden süspansiyondan sonra polisomal peletlerden saflaştırılır. Hem TOTAL hem de PAR, RNA-seks için dizileme kütüphanelerinin kalite standartlarını karşılamak için oldukça hassas kılcal elektroforez ile değerlendirilir. Bir aşağı akış uygulamasına örnek olarak, dizilemeden sonra, transkriptom ve translatom seviyelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genleri elde etmek için gen ekspresyon analizi için standart boru hatları kullanılabilir. Özetle, bu yöntem, RNA-sek ile kombinasyon halinde, simbiyotik nodül gibi karmaşık bir dokuda ökaryotik mRNA’ların translasyonel regülasyonunun incelenmesine izin verir.

Introduction

Soya fasulyesi (Glycine max) gibi baklagil bitkileri, rizobia adı verilen spesifik toprak bakterileri ile simbiyoz oluşturabilir. Bu karşılıklı ilişki, bitki kökleri üzerinde yeni organların, simbiyotik nodüllerin oluşumunu ortaya çıkarır. Nodüller, bakterileri barındıran bitki organlarıdır ve sitoplazması bakterioidler adı verilen özel bir rizobya formu ile kolonize edilen konakçı hücrelerden oluşur. Bu bakterioidler, atmosferik azotun (N2) amonyağa indirgenmesini katalize eder ve bu da karbonhidratlar karşılığında bitkiye aktarılır 1,2.

Bu azot sabitleyici simbiyoz, en iyi çalışılmış bitki-mikrop simbiyozlarından biri olmasına rağmen, farklı abiyotik stres koşullarına maruz kalan bitkilerin simbiyotik partnerleriyle etkileşimlerini nasıl modüle ettikleri ve bunun nodül metabolizmasını nasıl etkilediği gibi birçok yönün daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Bu süreçler, nodül translatomunu (yani, aktif olarak çevrilen mesajcı RNA’ların [mRNA’lar] alt kümesini) analiz ederek daha iyi anlaşılabilir. Poliribozomlar veya polizomlar, translasyon3’ü incelemek için yaygın olarak kullanılan, mRNA ile ilişkili çoklu ribozomların kompleksleridir. Polizom profilleme yöntemi, polizomlarla ilişkili mRNA’ların analizinden oluşur ve çeşitli biyolojik süreçlerde meydana gelen gen ekspresyonunu kontrol eden posttranskripsiyonel mekanizmaları incelemek için başarıyla kullanılmıştır 4,5.

Tarihsel olarak, genom ekspresyon analizi öncelikle mRNA bolluğunu belirlemeye odaklanmıştır 6,7,8,9. Bununla birlikte, gen ekspresyonunun posttranskripsiyonel düzenlemesinin farklı aşamaları, özellikle de translasyon10,11,12 nedeniyle transkript ve protein seviyeleri arasında korelasyon eksikliği vardır. Ayrıca, transkriptom seviyesindeki değişiklikler ile translatom13 seviyesinde meydana gelenler arasında herhangi bir bağımlılık gözlenmemiştir. Çevrilmekte olan mRNA setinin doğrudan analizi, hücre gen ekspresyonunun (son noktası protein bolluğu olan) sadece mRNA seviyeleri analiz edildiğinde elde edilenden daha doğru ve eksiksiz bir ölçümünü sağlar14,15,16.

Bu protokol, bitki kaynaklı polizomların, iki katmanlı bir sakkaroz yastığı aracılığıyla diferansiyel santrifüjleme ile bozulmamış soya fasulyesi nodüllerinden nasıl saflaştırıldığını açıklar (Şekil 1). Bununla birlikte, nodüllerde bakterioid kaynaklı ribozomlar da bulunduğundan, ökaryotik olanlar ana fraksiyonu (% 90 -% 95) temsil etse de, ribozomların ve RNA türlerinin bir karışımı saflaştırılır. Sonraki RNA izolasyonu, nicelleştirme ve kalite kontrolü de tanımlanmıştır (Şekil 1). Bu protokol, RNA-sek ile kombinasyon halinde, simbiyotik nodül gibi karmaşık bir dokudaki ökaryotik mRNA’ların translasyonel regülasyonu hakkında deneysel sonuçlar sağlamalıdır.

Figure 1
Şekil 1: Simbiyotik nodüllerden ökaryotik polizom saflaştırma için önerilen metodolojiye şematik genel bakış. Şema, (1) bitki büyümesi ve (2) nodül hasadından (3) sitozolik ekstraktların hazırlanmasına, (3) TOTAL numunelerinin ve (4) PAR numunelerinin elde edilmesine ve (5) RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolüne kadar protokolde izlenen adımlara genel bir bakış sunmaktadır. Kısaltmalar: PEB = polizom ekstraksiyon tamponu; RB = süspansiyon tamponu; TOPLAM = toplam RNA; PAR = polizomla ilişkili mRNA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Bitki büyümesi ve rizobya aşılaması Gerekli nodülleri üretmek için, seçilen soya fasulyesi tohumlarını seçilen substratta kontrollü koşullar altında bir büyüme odasına ekin.NOT: Bu protokolde, tohumlar kum: vermikülit karışımı ile doldurulmuş 0.5 L’lik plastik bir şişeye ekildi (1: 1). Büyüme odası, sırasıyla 28 °C / 20 °C gündüz / gece döngüsü sıcaklığı ve sırasıyla 16 saat / 8 saat açık / karanlık fotoperiyodu ile ayarlandı. Fotosentetik …

Representative Results

Yukarıda belirtilen prosedürle saflaştırılan TOTAL ve PAR fraksiyonlarının miktar ve kalite değerlendirmesi, başarısını belirlemenin anahtarıdır, çünkü RNA dizilimi gibi çoğu aşağı akış uygulaması için, yüksek kaliteli numuneler kütüphane hazırlama ve dizileme için temeldir. Dahası, RNA moleküllerinin bütünlüğü, numune toplama anında gen ekspresyon profilinin anlık görüntüsünün yakalanmasına izin verir18. Bu bağlamda, bu ölçümler bir Biyoanalizör …

Discussion

Gen ekspresyonu regülasyonunu translasyonel düzeyde incelemek, farklı biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir, çünkü hücre gen ekspresyonunun son noktası protein bolluğudur13,14. Bu, polisomal fraksiyonun saflaştırılması gereken ilgili doku veya organizmanın translatomunu analiz ederek ve ilişkili mRNA’larıanaliz ederek değerlendirilebilir 3,4,34,35,36.</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma CSIC I + D 2020 hibe No. 282, FVF 2017 hibe No. 210 ve PEDECIBA (María Martha Sainz) tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
  2. Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
  3. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  4. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  5. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
  6. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  7. Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
  8. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
  9. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  10. Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
  11. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
  13. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
  14. Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
  15. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  16. Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
  17. Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans. Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).
  18. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  19. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  23. . Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011)
  24. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  25. Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
  26. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  27. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
  28. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  29. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
  30. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
  31. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  32. Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
  33. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
  34. Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
  35. Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
  36. Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer’s disease model mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
  37. Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  38. Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
  39. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  40. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  41. Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
  42. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).

Tags

Keywords: Polysome PurificationSoybeanSymbiotic NodulesCentrifugationRNA-SeqPolysome Extraction BufferSucrose CushionUltracentrifugationRNA Isolation
check_url/64269?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sainz, M. M., Filippi, C. V., Eastman, G., Sotelo-Silveira, M., Martinez, C. M., Borsani, O., Sotelo-Silveira, J. Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules. J. Vis. Exp. (185), e64269, doi:10.3791/64269 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image