Summary

Purificação polissóbica de nódulos simbióticos de soja

Published: July 01, 2022
doi:

Summary

Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.

Abstract

O objetivo deste protocolo é fornecer uma estratégia para estudar o traduzindo eucariótico do nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este artigo descreve métodos otimizados para isolar poliribos derivados de plantas e seus mRNAs associados a serem analisados usando sequenciamento de RNA. Em primeiro lugar, os licoplasatos citoplasmados são obtidos através da homogeneização em condições de preservação de poliso e RNA de nódulos inteiros e congelados de soja. Em seguida, os lysates são limpos por centrifugação de baixa velocidade, e 15% do supernante é usado para o isolamento total do RNA (TOTAL). O restante do lise limpo é usado para isolar pórsomeos por ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%). O mRNA (PAR) associado ao polissomo é purificado a partir de pelotas polissonais após a ressuspensão. Tanto total quanto PAR são avaliados por eletroforese capilar altamente sensível para atender aos padrões de qualidade das bibliotecas de sequenciamento para RNA-seq. Como exemplo de uma aplicação a jusante, após o sequenciamento, os pipelines padrão para análise de expressão genética podem ser usados para obter genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e tradução. Em resumo, este método, em combinação com o RNA-seq, permite o estudo da regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.

Introduction

Plantas leguminous, como a soja (Glycine max), podem estabelecer simbiose com bactérias específicas do solo chamadas rizobia. Essa relação mutualista provoca a formação de novos órgãos, os nódulos simbióticos, nas raízes das plantas. Os nódulos são os órgãos vegetais que hospedam as bactérias e consistem em células hospedeiras cujo citoplasma é colonizado com uma forma especializada de rizobia chamada bacteroides. Esses bacteroides catalisam a redução do nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, que é transferida para a planta em troca de carboidratos 1,2.

Embora essa simbiose fixador de nitrogênio seja uma das simbioses vegetais mais bem estudadas, muitos aspectos continuam sendo melhor compreendidos, como como as plantas submetidas a diferentes condições de estresse abiótico modulam sua interação com seu parceiro simbiótico e como isso afeta o metabolismo do nódulo. Esses processos poderiam ser melhor compreendidos analisando o translatome de nódulo (ou seja, o subconjunto de RNAs mensageiros [mRNAs] traduzido ativamente). Poliribosomes ou polissomos são complexos de ribossomos múltiplos associados ao mRNA, comumente usado para estudar a tradução3. O método de perfil polisome consiste na análise dos mRNAs associados aos polissomos e tem sido utilizado com sucesso para estudar os mecanismos pós-transcriionais que controlam a expressão genética que ocorre em diversos processos biológicos 4,5.

Historicamente, a análise da expressão do genoma tem focado principalmente na determinação da abundância de mRNA 6,7,8,9. No entanto, há falta de correlação entre a transcrição e os níveis de proteína devido aos diferentes estágios de regulação pós-escrita da expressão genética, particularmente a tradução 10,11,12. Além disso, não foi observada dependência entre as alterações no nível do transcriptome e aquelas que ocorrem no nível do traduzome13. A análise direta do conjunto de mRNAs que estão sendo traduzidos permite uma medição mais precisa e completa da expressão genética celular (cujo ponto final é a abundância de proteínas) do que a obtida quando apenas os níveis de mRNA são analisados 14,15,16.

Este protocolo descreve como os polimentos derivados das plantas são purificados de nódulos de soja intactos por centrifugação diferencial através de uma almofada de sacarose de duas camadas (Figura 1). No entanto, uma vez que os ribossomos derivados de bacteroides também estão presentes nos nódulos, uma mistura de ribossomos e espécies de RNA são purificadas, embora as eucarióticas representem a fração principal (90%-95%). O subsequente isolamento do RNA, quantificação e controle de qualidade também são descritos (Figura 1). Este protocolo, em combinação com o RNA-seq, deve fornecer resultados experimentais sobre a regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.

Figure 1
Figura 1: Visão geral esquemática da metodologia proposta para purificação de pórsomee eucariótico a partir de nódulos simbióticos. O esquema fornece uma visão geral das etapas seguidas no protocolo de (1) crescimento vegetal e (2) colheita de nódulos até (3) preparação dos extratos citolíticos, (3) obtenção de amostras TOTAIS e (4) amostras PAR e (5) extração e controle de qualidade do RNA. Abreviaturas: PEB = tampão de extração políduo; RB = tampão de resuspensão; TOTAL = RNA total; PAR = mRNA associado ao polissomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Crescimento vegetal e inoculação de rizobia Para gerar os nódulos necessários, semeie as sementes de soja escolhidas no substrato selecionado em uma câmara de crescimento em condições controladas.NOTA: Neste protocolo, as sementes foram semeadas em uma garrafa plástica de 0,5 L recheada com uma mistura de areia:vermiculite (1:1). A câmara de crescimento foi definida com uma temperatura do ciclo dia/noite de 28 °C /20 °C, respectivamente, e um fotoperíodo de luz/escuridão de …

Representative Results

A quantidade e a avaliação da qualidade das frações TOTAL e PAR purificadas com o procedimento acima mencionado é fundamental para determinar seu sucesso, uma vez que para a maioria das aplicações a jusante, como sequenciamento de RNA, amostras de alta qualidade são fundamentais para a preparação e sequenciamento da biblioteca. Além disso, a integridade das moléculas de RNA permite a captura de um instantâneo do perfil de expressão genética no momento da coleta da amostra18. Neste c…

Discussion

Estudar a regulação da expressão genética no nível translacional é fundamental para compreender melhor diferentes processos biológicos, uma vez que o ponto final da expressão genética celular é a abundância deproteínas 13,14. Isso pode ser avaliado analisando o translatório do tecido ou organismo de interesse para o qual a fração polissômica deve ser purificada e seus mRNAs associados analisaram 3,4,34,35,36.<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiada pela bolsa CSIC I+D 2020 nº 282, FVF 2017 grant No. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207

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Sainz, M. M., Filippi, C. V., Eastman, G., Sotelo-Silveira, M., Martinez, C. M., Borsani, O., Sotelo-Silveira, J. Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules. J. Vis. Exp. (185), e64269, doi:10.3791/64269 (2022).

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