JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Developmental Biology

Polysom rensing fra soyabønner Symbiotic Nodules

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64269
, , , , , ,
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía,Universidad de la República, 2Departamento de Genómica,Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology,University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias,Universidad de la República

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for eukaryotisk polysomrensing fra intakte soyabønneknuter. Etter sekvensering kan standard rørledninger for genuttrykksanalyse brukes til å identifisere differensielt uttrykte gener på transkriptom- og translatomnivå.

Abstract

Målet med denne protokollen er å gi en strategi for å studere eukaryotisk translatom av soyabønner (Glycine max) symbiotisk knute. Dette papiret beskriver metoder optimalisert for å isolere planteavledede polyribosomer og deres tilhørende mRNA som skal analyseres ved hjelp av RNA-sekvensering. Først oppnås cytoplasmatiske lysater gjennom homogenisering i polysom- og RNA-bevarende forhold fra hele, frosne soyabønneknuter. Deretter fjernes lysater ved lavhastighets sentrifugering, og 15% av supernatanten brukes til total RNA (TOTAL) isolasjon. Det gjenværende klarerte lysatet brukes til å isolere polysomer ved ultrasentrifugering gjennom en tolags sukrosepute (12% og 33,5%). Polysomassosiert mRNA (PAR) renses fra polysomale pellets etter resuspendering. Både TOTAL og PAR evalueres ved høysensitiv kapillærelektroforese for å oppfylle kvalitetsstandardene for sekvenseringsbiblioteker for RNA-seq. Som et eksempel på en nedstrøms applikasjon, etter sekvensering, kan standard rørledninger for genuttrykksanalyse brukes til å oppnå differensielt uttrykte gener på transkriptom- og translatomnivå. Oppsummert tillater denne metoden, i kombinasjon med RNA-seq, studiet av translasjonsreguleringen av eukaryote mRNA i et komplekst vev som den symbiotiske knuten.

Introduction

Leguminøse planter, som soyabønne (Glycine max), kan etablere symbiose med spesifikke jordbakterier kalt rhizobia. Dette mutualistiske forholdet fremkaller dannelsen av nye organer, de symbiotiske knutene, på planterøttene. Knutene er planteorganene som er vert for bakteriene og består av vertsceller hvis cytoplasma er kolonisert med en spesialisert form for rhizobia kalt bakterier. Disse bakterieoidene katalyserer reduksjonen av atmosfærisk nitrogen (N 2) til ammoniakk, som overføres til planten i retur for karbohydrater 1,2.

Selv om denne nitrogenfikserende symbiosen er en av de mest studerte plantemikrobesymbiosene, gjenstår mange aspekter å bli bedre forstått, for eksempel hvordan planter utsatt for forskjellige abiotiske stressforhold modulerer samspillet med deres symbiotiske partner og hvordan dette påvirker knutemetabolismen. Disse prosessene kan forstås bedre ved å analysere knutetranslatomet (dvs. delmengden av messenger-RNA [mRNA] aktivt oversatt). Polyribosomer eller polysomer er komplekser av flere ribosomer assosiert med mRNA, som vanligvis brukes til å studere oversettelse3. Polysomprofileringsmetoden består av analysen av mRNA assosiert med polysomer og har blitt brukt til å studere posttranskripsjonsmekanismer som styrer genuttrykk som forekommer i ulike biologiske prosesser 4,5.

Historisk sett har genomuttrykksanalyse primært fokusert på å bestemme mRNA-overflod 6,7,8,9. Imidlertid er det mangel på korrelasjon mellom transkripsjon og proteinnivåer på grunn av de forskjellige stadiene av posttranskripsjonell regulering av genuttrykk, spesielt oversettelse10,11,12. Videre er det ikke observert avhengighet mellom endringene på transkriptomnivået og de som forekommer på translatomnivået13. Den direkte analysen av settet av mRNA som oversettes, tillater en mer nøyaktig og fullstendig måling av cellegenuttrykket (hvis endepunkt er proteinoverflod) enn det som oppnås når bare mRNA-nivåer analyseres14,15,16.

Denne protokollen beskriver hvordan planteavledede polysomer renses fra intakte soyabønneknuter ved differensiell sentrifugering gjennom en tolags sukrosepute (figur 1). Men siden bakterieformede ribosomer også er tilstede i knutene, blir en blanding av ribosomer og RNA-arter renset, selv om de eukaryote representerer hovedfraksjonen (90% -95%). Den påfølgende RNA-isolasjonen, kvantifiseringen og kvalitetskontrollen er også beskrevet (figur 1). Denne protokollen, i kombinasjon med RNA-seq, skal gi eksperimentelle resultater på translasjonsregulering av eukaryote mRNA i et komplekst vev som den symbiotiske knuten.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over foreslått metodikk for eukaryotisk polysomrensing fra symbiotiske knuter. Ordningen gir en oversikt over trinnene som følges i protokollen fra (1) plantevekst og (2) knutehøsting til (3) fremstilling av cytosoliske ekstrakter, (3) innhenting av TOTAL-prøver og (4) PAR-prøver, og (5) RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll. Forkortelser: PEB = polysomekstraksjonsbuffer; RB = resuspension buffer; TOTALT = totalt RNA; PAR = polysomassosiert mRNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. Plantevekst og rhizobia inokulasjon For å generere de nødvendige knutene, så soyabønnefrøene som er valgt i det valgte substratet i et vekstkammer under kontrollerte forhold.MERK: I denne protokollen ble frø sådd i en 0,5 L plastflaske fylt med en blanding av sand: vermikulitt (1: 1). Vekstkammeret ble satt med en dag/natt-syklustemperatur på henholdsvis 28 °C/20 °C og en lys/mørke-fotoperiode på 16 timer/8 timer. Den fotosyntetisk aktive strålingsintensiteten var 620 μmol?…

Representative Results

Kvantitets- og kvalitetsvurderingen av TOTAL- og PAR-fraksjonene renset med ovennevnte prosedyre er nøkkelen til å bestemme suksessen, siden for de fleste nedstrømsapplikasjoner, for eksempel RNA-sekvensering, er prøver av høy kvalitet grunnleggende for bibliotekforberedelse og sekvensering. Videre tillater integriteten til RNA-molekylene fangst av et øyeblikksbilde av genuttrykksprofilen i øyeblikket av prøveinnsamling18. I denne sammenheng oppnås et RNA-integritetsnummer (RIN) ved utfø…

Discussion

Å studere regulering av genuttrykk på translasjonsnivå er avgjørende for å bedre forstå forskjellige biologiske prosesser siden endepunktet for cellegenuttrykk er proteinoverflod13,14. Dette kan vurderes ved å analysere translatomet av vevet eller organismen av interesse som den polysomale fraksjonen skal renses for og tilhørende mRNA analyseres 3,4,34,35,36.<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble finansiert av CSIC I + D 2020-stipend nr. 282, FVF 2017-stipend nr. 210 og PEDECIBA (María Martha Sainz).

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
  2. Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
  3. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  4. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  5. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
  6. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  7. Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
  8. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
  9. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  10. Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
  11. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
  13. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
  14. Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
  15. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  16. Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
  17. Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans. Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).
  18. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  19. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  23. . Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011)
  24. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  25. Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
  26. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  27. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
  28. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  29. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
  30. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
  31. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  32. Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
  33. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
  34. Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
  35. Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
  36. Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer’s disease model mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
  37. Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  38. Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
  39. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  40. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  41. Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
  42. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).

Tags

Keywords: Polysome PurificationSoybeanSymbiotic NodulesCentrifugationRNA-SeqPolysome Extraction BufferSucrose CushionUltracentrifugationRNA Isolation
check_url/64269?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sainz, M. M., Filippi, C. V., Eastman, G., Sotelo-Silveira, M., Martinez, C. M., Borsani, O., Sotelo-Silveira, J. Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules. J. Vis. Exp. (185), e64269, doi:10.3791/64269 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image