JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Polysomrening från sojabönor Symbiotic Nodules

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64269
, , , , , ,
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía,Universidad de la República, 2Departamento de Genómica,Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology,University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias,Universidad de la República

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för eukaryot polysomrening från intakta sojabönor. Efter sekvensering kan standardpipelines för genuttrycksanalys användas för att identifiera differentiellt uttryckta gener på transkriptom- och translatomnivåerna.

Abstract

Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en strategi för att studera det eukaryota överlatomet av sojabönan (Glycine max) symbiotisk knöl. Detta dokument beskriver metoder optimerade för att isolera växtbaserade polyribosomer och deras associerade mRNA som ska analyseras med RNA-sekvensering. Först erhålls cytoplasmatiska lysater genom homogenisering i polysom- och RNA-bevarande förhållanden från hela, frysta sojabönknutor. Därefter rensas lysater genom låghastighetscentrifugering, och 15% av supernatanten används för total RNA (TOTAL) isolering. Det återstående rensade lysatet används för att isolera polysomer genom ultracentrifugering genom en tvåskikts sackaroskudde (12% och 33,5%). Polysomassocierat mRNA (PAR) renas från polysomala pellets efter resuspension. Både TOTAL och PAR utvärderas av mycket känslig kapillärelektrofores för att uppfylla kvalitetsstandarderna för sekvenseringsbibliotek för RNA-seq. Som ett exempel på en nedströms applikation, efter sekvensering, kan standardrörledningar för genuttrycksanalys användas för att erhålla differentiellt uttryckta gener på transkriptom- och translatomnivåerna. Sammanfattningsvis möjliggör denna metod, i kombination med RNA-seq, studier av translationell reglering av eukaryota mRNA i en komplex vävnad såsom den symbiotiska knölen.

Introduction

Baljväxter, såsom sojabönor (Glycine max), kan etablera symbios med specifika jordbakterier som kallas rhizobia. Detta mutualistiska förhållande framkallar bildandet av nya organ, de symbiotiska knölarna, på växtrötterna. Knölarna är växtorganen som är värd för bakterierna och består av värdceller vars cytoplasma koloniseras med en specialiserad form av rhizobia som kallas bakterioider. Dessa bakterioider katalyserar reduktionen av atmosfäriskt kväve (N2) till ammoniak, som överförs till växten i utbyte mot kolhydrater 1,2.

Även om denna kvävefixerande symbios är en av de mest välstuderade växt-mikrobsymbioserna, återstår många aspekter att förstå bättre, till exempel hur växter som utsätts för olika abiotiska stressförhållanden modulerar deras interaktion med sin symbiotiska partner och hur detta påverkar knölmetabolismen. Dessa processer kan förstås bättre genom att analysera knöltranslatomet (dvs. delmängden av budbärar-RNA [mRNA] som aktivt översätts). Polyribosomer eller polysomer är komplex av flera ribosomer associerade med mRNA, som vanligtvis används för att studera översättning3. Polysomprofileringsmetoden består av analys av mRNA associerade med polysomer och har framgångsrikt använts för att studera de posttranskriptionella mekanismerna som styr genuttryck som förekommer i olika biologiska processer 4,5.

Historiskt sett har genomuttrycksanalys främst fokuserat på att bestämma mRNA-överflöd 6,7,8,9. Det finns emellertid en brist på korrelation mellan transkript- och proteinnivåer på grund av de olika stadierna av posttranskriptionell reglering av genuttryck, särskilt översättning10,11,12. Dessutom har inget beroende observerats mellan förändringarna på transkriptomets nivå och de som uppträder vid translatomets nivå13. Den direkta analysen av den uppsättning mRNA som översätts möjliggör en mer exakt och fullständig mätning av cellgenuttrycket (vars slutpunkt är proteinmängd) än den som erhålls när endast mRNA-nivåer analyseras14,15,16.

Detta protokoll beskriver hur växtbaserade polysomer renas från intakta sojabönknutor genom differentiell centrifugering genom en tvåskikts sackaroskudde (figur 1). Men eftersom bakterioid-härledda ribosomer också finns i knölarna, renas en blandning av ribosomer och RNA-arter, även om de eukaryota representerar huvudfraktionen (90% -95%). Den efterföljande RNA-isoleringen, kvantifieringen och kvalitetskontrollen beskrivs också (figur 1). Detta protokoll, i kombination med RNA-seq, bör ge experimentella resultat om translationell reglering av eukaryota mRNA i en komplex vävnad såsom den symbiotiska knölen.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över den föreslagna metoden för eukaryot polysomrening från symbiotiska knölar. Schemat ger en översikt över de steg som följs i protokollet från (1) växttillväxt och (2) knölskörd till (3) beredning av cytosolextrakten, (3) erhållande av TOTAL-prover och (4) PAR-prover och (5) RNA-extraktion och kvalitetskontroll. Förkortningar: PEB = polysomextraktionsbuffert; RB = resuspensionsbuffert; TOTALT = totalt RNA; PAR = polysomassocierat mRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Växttillväxt och rhizobia inokulering För att generera de nödvändiga knölarna, så de sojabönor som valts i det valda substratet i en tillväxtkammare under kontrollerade förhållanden.OBS: I detta protokoll såddes frön i en 0,5 L plastflaska fylld med en blandning av sand: vermikulit (1: 1). Tillväxtkammaren ställdes in med en dag/natt-cykeltemperatur på 28 °C /20 °C respektive en ljus/mörkerfotoperiod på 16 h/8 h. Den fotosyntetiskt aktiva strålningsintensiteten var 6…

Representative Results

Kvantitets- och kvalitetsbedömningen av TOTAL- och PAR-fraktionerna renade med ovannämnda förfarande är nyckeln till att bestämma dess framgång, eftersom för de flesta nedströmsapplikationer, såsom RNA-sekvensering, är högkvalitativa prover grundläggande för biblioteksberedning och sekvensering. Dessutom möjliggör RNA-molekylernas integritet att fånga en ögonblicksbild av genuttrycksprofilen vid tidpunkten för provsamlingen18. I detta sammanhang erhålls ett RNA-integritetsnummer…

Discussion

Att studera genuttrycksreglering på translationell nivå är avgörande för att bättre förstå olika biologiska processer eftersom slutpunkten för cellgenuttryck är proteinförekomst13,14. Detta kan bedömas genom att analysera translatomet hos vävnaden eller organismen av intresse för vilken den polysomala fraktionen ska renas och dess associerade mRNA analyseras 3,4,34,35,36.<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning finansierades av CSIC I + D 2020 bidrag nr 282, FVF 2017 bidrag nr 210 och PEDECIBA (María Martha Sainz).

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
  2. Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
  3. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  4. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  5. Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
  6. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  7. Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
  8. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
  9. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  10. Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
  11. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
  13. Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
  14. Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
  15. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  16. Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
  17. Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans. Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).
  18. Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
  19. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
  20. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  23. . Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011)
  24. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  25. Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
  26. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  27. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
  28. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  29. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
  30. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
  31. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  32. Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
  33. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
  34. Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
  35. Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
  36. Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer’s disease model mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
  37. Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
  38. Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
  39. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  40. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  41. Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
  42. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).

Tags

Keywords: Polysome PurificationSoybeanSymbiotic NodulesCentrifugationRNA-SeqPolysome Extraction BufferSucrose CushionUltracentrifugationRNA Isolation
check_url/64269?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sainz, M. M., Filippi, C. V., Eastman, G., Sotelo-Silveira, M., Martinez, C. M., Borsani, O., Sotelo-Silveira, J. Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules. J. Vis. Exp. (185), e64269, doi:10.3791/64269 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image