펩티드-폴록사민 나노입자를 사용하여 배양된 세포에서 시험관내 트랜스크립션된 mRNA의 효율적인 형질감염
Summary
자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp)는 미세유체 혼합 장치를 사용하여 개발 되어 시험관 내 전사된 메신저 RNA를 캡슐화하고 전달합니다. 기술된 mRNA/PP-sNip는 배양된 세포를 시험관내에서 효율적으로 형질감염시킬 수 있었다.
Abstract
시험관 내 전사 메신저 RNA (mRNA) 백신은 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병에 맞서 싸울 수있는 엄청난 잠재력을 보여주었습니다. 효율적이고 안전한 전달 시스템은 mRNA의 깨지기 쉬운 특성으로 인해 mRNA 백신에 포함되어야 한다. 자체 조립된 펩타이드-폴록사민 나노입자(PP-sNp) 유전자 전달 시스템은 핵산의 폐 전달을 위해 특별히 설계되었으며 성공적인 mRNA 트랜스펙션을 매개하는 데 유망한 능력을 표시합니다. 여기서, PP-sNap을 제조하기 위한 개선된 방법이 PP-sNap이 어떻게 메트리디아 루시퍼라제(MetLuc) mRNA를 캡슐화하고 배양된 세포를 성공적으로 형질감염시키는지에 대해 상세히 설명한다. MetLuc-mRNA는 선형 DNA 주형으로부터 시험관내 전사 과정에 의해 수득된다. PP-sNp는 미세 유체 혼합기를 사용하여 합성 펩타이드 / 폴록사민과 mRNA 용액을 혼합하여 PP-sNp의 자체 조립을 가능하게하여 생산됩니다. PP-sNp의 전하는 후속적으로 제타 전위를 측정함으로써 평가된다. 한편, PP-sNp 나노입자의 다분산도 및 유체역학적 크기는 동적 광산란을 이용하여 측정된다. mRNA/PP-sNp 나노입자는 배양된 세포로 형질감염되고, 세포 배양물로부터의 상청액은 루시퍼라제 활성에 대해 분석된다. 대표적인 결과는 시험관내 형질감염에 대한 그들의 능력을 입증한다. 이 프로토콜은 차세대 mRNA 백신 전달 시스템 개발에 빛을 비출 수 있습니다.
Introduction
예방 접종은 전염병으로 인한 이환률 및 사망률을 줄이기위한 가장 효율적인 의료 개입 중 하나로 예고되었습니다1. 백신의 중요성은 2019 년 코로나 바이러스 질병 (COVID-19)이 발병 한 이래로 입증되었습니다. 불활성화 또는 약독화된 병원체를 주입하는 전통적인 개념과는 달리, 핵산 기반 백신과 같은 최첨단 백신 접근법은 기존의 전체 미생물 바이러스 또는 박테리아 기반 백신과 관련된 잠재적 안전성 문제를 피하면서 표적 병원체의 면역 자극 특성을 보존하는 데 집중한다. DNA- 및 RNA (즉, 시험관내 전사된 메신저 RNA, IVT mRNA) 둘 다-기반 백신은 감염성 질환 및 암을 포함하는 다양한 질병에 대한 치료 잠재력에 대한 예방적 잠재력을 나타낸다 2,3. 원칙적으로, 핵산 기반 백신의 잠재력은 그들의 생산, 효능 및 안전성과 관련된다4. 이러한 백신은 비용 효율적이고 확장 가능하며 신속한 생산을 가능하게하기 위해 무세포 방식으로 제조 될 수 있습니다.
단일 핵산 기반 백신은 다중 항원을 인코딩하여 수많은 바이러스 변이체 또는 박테리아의 표적을 접종 횟수를 줄이고 탄력적 인 병원체에 대한 면역 반응을 강화할 수 있습니다 5,6. 게다가, 핵산 기반 백신은 바이러스 또는 박테리아 감염의 자연 침입 과정을 모방하여 B 세포 및 T 세포 매개 면역 반응을 가져올 수 있습니다. 일부 바이러스 또는 DNA 기반 백신과 달리 IVT mRNA 기반 백신은 안전성 측면에서 큰 이점을 제공합니다. 이들은 시토졸에서 원하는 항원을 신속하게 발현할 수 있고 숙주 게놈에 통합되지 않아 삽입 돌연변이유발에 대한 우려를 없애고7. IVT-mRNA는 성공적인 번역 후 자동으로 분해되므로 단백질 발현 동역학을 쉽게 조절할 수 있습니다 8,9. 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2) 전염병에 의해 촉매 된 전 세계 기업 / 기관의 노력으로 많은 유형의 백신 시장에 출시 될 수있었습니다. IVT mRNA 기반 백신 기술은 큰 잠재력을 보여 주며, 몇 달 내에 모든 표적 항원에 적응할 수있는 신속한 설계와 유연한 능력으로 인해 이전에 예상 된 성공을 처음으로 입증했습니다. 임상 응용 분야에서 COVID-19에 대한 IVT mRNA 백신의 성공은 IVT mRNA 백신 연구 개발의 새로운 시대를 열었을 뿐만 아니라 전염병10,11의 발생을 다루기위한 효과적인 백신의 신속한 개발을위한 귀중한 경험을 축적했습니다.
IVT mRNA 백신의 유망한 잠재성에도 불구하고, 작용 부위(즉, 세포질)로의 IVT mRNA의 효율적인 세포내 전달은 특히 기도(4)를 통해 투여되는 사람들에게 계속해서 주요한 장애물(12)을 제기한다. IVT mRNA는 본질적으로 매우 짧은 반감기 (∼7 h)13을 갖는 불안정한 분자이며, 이는 IVT mRNA가 유비쿼터스 RNase14에 의해 분해되기 매우 쉽다. 선천적 면역계의 림프구는 생체내 적용의 경우에 인식된 IVT mRNA를 삼키는 경향이 있다. 더욱이, IVT mRNA의 높은 음전하 밀도 및 큰 분자량 (1 x 104-1 x 106 Da)은 세포막(15)의 음이온성 지질 이중층을 가로 지르는 그의 효과적인 투과를 손상시킨다. 따라서, IVT mRNA 분자의 분해를 억제하고 세포 흡수(16)를 촉진하기 위해 특정 생체기능성 물질을 갖는 전달 시스템이 요구된다.
네이키드 IVT mRNA가 생체내 조사를 위해 직접 활용된 몇 가지 예외적인 경우와는 별개로, 다양한 전달 시스템이 IVT mRNA를 작용부위 17,18로 운반하는데 사용된다. 이전의 연구들은 단지 몇몇 IVT mRNA들이 전달 시스템(19)의 도움 없이 시토졸에서 검출된다는 것을 밝혀냈다. 프로타민 축합에서 지질 캡슐화(20)에 이르기까지 현장에서 지속적인 노력으로 RNA 전달을 개선하기 위한 수많은 전략이 개발되었다. 지질 나노입자(LNPs)는 mRNA 전달 비히클 중에서 가장 임상적으로 진보된 것으로, 임상적으로 사용하기 위해 승인된 모든 mRNA COVID-19 백신이 LNP 기반 전달 시스템(21)을 사용한다는 사실에 의해 입증되었다. 그러나, LNPs는 제형이 호흡 경로(22)를 통해 전달될 때 효과적인 mRNA 형질감염을 매개할 수 없으며, 이는 점막 면역 반응을 유도하거나 낭포성 섬유증 또는 α1-안티트립신 결핍과 같은 폐 관련 질환을 해결하는 데 이들 제형의 적용을 현저하게 제한한다. 따라서, 이러한 미충족 문제를 해결하기 위해 기도 관련 세포에서 IVT mRNA의 효율적인 전달 및 형질감염을 용이하게 하기 위한 신규한 전달 시스템의 개발이 요구된다.
펩티드-폴록사민 자기조립된 나노입자(PP-sNp) 전달 시스템이 마우스23의 호흡기에서 핵산의 효율적인 형질감염을 매개할 수 있음이 확인되었다. PP-sNp는 다기능 모듈식 설계 접근 방식을 채택하여 다양한 기능 모듈을 나노 입자에 통합하여 신속한 스크리닝 및 최적화(23)를 수행 할 수 있습니다. PP-sNp 내의 합성 펩티드 및 전기적으로 중성인 양친매성 블록 코폴리머(폴록사민)는 IVT mRNA와 자발적으로 상호작용하여 조밀한 구조 및 매끄러운 표면(23)을 갖는 균일하게 분포된 나노입자를 생성할 수 있다. PP-sNip은 마우스(23)의 배양된 세포 및 호흡기에서 IVT mRNA 분자의 유전자 형질감염 효과를 향상시킬 수 있다. 본 연구는 Metridia luciferase (MetLuc-mRNA)를 인코딩하는 IVT mRNA를 함유하는 PP-sNp를 생성하기 위한 프로토콜을 기술한다(도 1). 비틀거리는 헤링본 혼합 설계를 사용하는 미세유체 혼합 장치를 통한 제어 및 신속한 혼합이 이 프로토콜에 활용됩니다. 이 절차는 실행하기 쉽고 더 균일 한 크기의 PP-sNp를 생성 할 수 있습니다. 미세유체 혼합기를 이용한 PP-sNp 생산의 일반적인 목표는 잘 조절된 방식으로 mRNA 복합체화를 위한 PP-sNp를 생성하고, 따라서 시험관내에서 효율적이고 재현 가능한 세포 형질감염을 가능하게 하는 것이다. 본 프로토콜은 MetLuc-mRNA를 함유하는 PP-sNp의 제조, 조립 및 특성화를 기술한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기술된 프로토콜은 정의된 특성을 갖는 IVT mRNA 백신 제형의 비용 효율적이고 신속한 생산을 가능하게 할 뿐만 아니라, 유전자 요법과 같은 특정 치료 목적에 따라 PP-sNp 제형을 맞춤화할 수 있는 가능성을 제공한다. IVT mRNA/PP-sNp의 성공적인 생성을 보장하기 위해, 몇 가지 중요한 단계에 각별한 주의를 기울이는 것이 좋습니다. mRNA와 함께 작업할 때, IVT mRNA가 화학적 변형으로 제조되었더라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC, 보조금 번호 82041045 및 82173764), 중국 과학 기술부의 병인 및 전염병 예방 기술 시스템 연구 (2021YFC2302500), 충칭 인재 : 탁월한 젊은 인재 프로젝트 (CQYC202005027) 및 충칭 자연 과학 재단 (cstc2021jcyj-msxmX0136)의 지원을 받았다. 저자들은 유체역학적 직경 (nm)과 다분산 지수 (PDI)를 측정 한 Xiaoyan Ding 박사에게 감사드립니다.
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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