Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln
Summary
Ein selbstorganisiertes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp) wird unter Verwendung einer mikrofluidischen Mischvorrichtung entwickelt, um in vitro transkribierte Boten-RNA zu verkapseln und zu liefern. Die beschriebene mRNA/PP-sNp konnte kultivierte Zellen in vitro effizient transfizieren.
Abstract
In-vitro-transkribierte Boten-RNA (mRNA)-Impfstoffe haben ein enormes Potenzial im Kampf gegen die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) gezeigt. Aufgrund der fragilen Eigenschaften der mRNA müssen effiziente und sichere Verabreichungssysteme in die mRNA-Impfstoffe aufgenommen werden. Ein selbstorganisierendes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp)-Genabgabesystem wurde speziell für die pulmonale Abgabe von Nukleinsäuren entwickelt und zeigt vielversprechende Fähigkeiten bei der Vermittlung einer erfolgreichen mRNA-Transfektion. Hier wird eine verbesserte Methode zur Herstellung von PP-sNp beschrieben, um zu erläutern, wie das PP-sNp Metridia luciferase (MetLuc) mRNA einkapselt und kultivierte Zellen erfolgreich transfiziert. MetLuc-mRNA wird durch einen in vitro Transkriptionsprozess aus einer linearen DNA-Vorlage gewonnen. Ein PP-sNp wird durch Mischen von synthetischem Peptid / Poloxamin mit mRNA-Lösung unter Verwendung eines mikrofluidischen Mischers hergestellt, was die Selbstorganisation von PP-sNp ermöglicht. Die Ladung von PP-sNp wird anschließend durch Messung des Zetapotentials bewertet. Gleichzeitig werden die Polydispersität und hydrodynamische Größe von PP-sNp-Nanopartikeln mittels dynamischer Lichtstreuung gemessen. Die mRNA/PP-sNp-Nanopartikel werden in kultivierte Zellen transfiziert, und Überstände aus der Zellkultur werden auf Luciferase-Aktivität untersucht. Die repräsentativen Ergebnisse belegen ihre Fähigkeit zur In-vitro-Transfektion . Dieses Protokoll könnte Aufschluss über die Entwicklung von mRNA-Impfstoffverabreichungssystemen der nächsten Generation geben.
Introduction
Die Impfung gilt als eine der effizientesten medizinischen Maßnahmen zur Verringerung der Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten1. Die Bedeutung von Impfstoffen zeigt sich seit dem Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Im Gegensatz zum traditionellen Konzept der Injektion inaktivierter oder lebend attenuierter Krankheitserreger konzentrieren sich moderne Impfstoffansätze, wie z. B. Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis, darauf, die immunstimulierenden Eigenschaften der Zielpathogene zu erhalten und gleichzeitig die potenziellen Sicherheitsprobleme zu vermeiden, die mit den herkömmlichen ganzmikrobiellen Virus- oder bakterienbasierten Impfstoffen verbunden sind. Sowohl DNA- als auch RNA-Impfstoffe (d. h. in vitro transkribierte Boten-RNA, IVT mRNA) weisen ein prophylaktisches bis therapeutisches Potenzial gegen eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Infektionskrankheiten undKrebs, auf 2,3. Grundsätzlich bezieht sich das Potenzial von Impfstoffen auf Nukleinsäurebasis auf ihre Herstellung, Wirksamkeit und Sicherheit4. Diese Impfstoffe können zellfrei hergestellt werden, um eine kostengünstige, skalierbare und schnelle Produktion zu ermöglichen.
Ein einziger Impfstoff auf Nukleinsäurebasis kann mehrere Antigene kodieren, was das Ziel zahlreicher viraler Varianten oder Bakterien mit einer reduzierten Anzahl von Impfungen ermöglicht und die Immunantwort gegen resistente Krankheitserreger stärkt 5,6. Außerdem könnten Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis den natürlichen Invasionsprozess von Virus- oder Bakterieninfektionen nachahmen und sowohl B-Zell- als auch T-Zell-vermittelte Immunantworten hervorrufen. Im Gegensatz zu einigen virus- oder DNA-basierten Impfstoffen bieten IVT-mRNA-basierte Impfstoffe einen großen Sicherheitsvorteil. Sie können das gewünschte Antigen schnell im Zytosol exprimieren und sind nicht in das Wirtsgenom integriert, was Bedenken hinsichtlich der Insertionsmutagenese beseitigt7. IVT-mRNA wird nach erfolgreicher Translation automatisch abgebaut, so dass ihre Proteinexpressionskinetik leicht kontrolliert werden kann 8,9. Katalysiert durch die Pandemie des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) haben die Bemühungen von Unternehmen / Institutionen weltweit die Markteinführung vieler Arten von Impfstoffen ermöglicht. Die IVT-mRNA-basierte Impfstofftechnologie zeigt großes Potenzial und hat zum ersten Mal ihren zuvor erwarteten Erfolg gezeigt, da sie schnell entwickelt und flexibel in der Lage ist, sich innerhalb weniger Monate an beliebige Zielantigene anzupassen. Der Erfolg von IVT-mRNA-Impfstoffen gegen COVID-19 in klinischen Anwendungen eröffnete nicht nur eine neue Ära der Forschung und Entwicklung von IVT-mRNA-Impfstoffen, sondern sammelte auch wertvolle Erfahrungen für die schnelle Entwicklung wirksamer Impfstoffe zur Behandlung von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten10,11.
Trotz des vielversprechenden Potenzials von IVT-mRNA-Impfstoffen stellt die effiziente intrazelluläre Abgabe von IVT-mRNA an den Wirkort (d. h. Zytoplasma) weiterhin eine große Hürdedar 12, insbesondere für diejenigen, die über die Atemwege verabreichtwerden 4. IVT mRNA ist von Natur aus ein instabiles Molekül mit einer extrem kurzen Halbwertszeit (~7 h)13, was IVT mRNA sehr anfällig für den Abbau durch die ubiquitäre RNase14 macht. Die Lymphozyten des angeborenen Immunsystems neigen dazu, die anerkannte IVT-mRNA in Fällen der in vivo-Anwendung zu verschlingen. Darüber hinaus beeinträchtigen die hohe negative Ladungsdichte und das große Molekulargewicht (1 x 104-1 x 106 Da) der IVT-mRNA ihre effektive Permeation über die anionische Lipiddoppelschicht von Zellmembranen15. Daher ist ein Abgabesystem mit bestimmten biofunktionellen Materialien erforderlich, um den Abbau der IVT-mRNA-Moleküle zu hemmen und die zelluläre Aufnahme zu erleichtern16.
Abgesehen von einigen Ausnahmefällen, in denen nackte IVT-mRNA direkt für in vivo Untersuchungen verwendet wurde, werden verschiedene Abgabesysteme verwendet, um IVT-mRNA zum therapeutischen Wirkortzu transportieren 17,18. Frühere Studien haben gezeigt, dass nur wenige IVT-mRNAs im Zytosol ohne die Hilfe eines Abgabesystems nachgewiesen werden19. Zahlreiche Strategien wurden entwickelt, um die RNA-Lieferung mit kontinuierlichen Bemühungen auf diesem Gebiet zu verbessern, die von der Protaminkondensation bis zur Lipidverkapselung reichen20. Lipid-Nanopartikel (LNPs) sind die klinisch am weitesten fortgeschrittenen mRNA-Verabreichungsvehikel, wie die Tatsache beweist, dass alle zugelassenen mRNA-COVID-19-Impfstoffe für den klinischen Gebrauch LNP-basierte Verabreichungssysteme verwenden21. LNPs können jedoch keine effektive mRNA-Transfektion vermitteln, wenn die Formulierungen über den respiratorischen Weg22 verabreicht werden, was die Anwendung dieser Formulierungen bei der Induktion von Schleimhautimmunantworten oder bei der Behandlung pulmonalbedingter Erkrankungen wie Mukoviszidose oder α1-Antitrypsin-Mangel bemerkenswert einschränkt. Daher ist die Entwicklung eines neuartigen Abgabesystems erforderlich, um die effiziente Abgabe und Transfektion von IVT-mRNA in atemwegsbezogenen Zellen zu erleichtern, um diesen ungedeckten Bedarf zu decken.
Es wurde bestätigt, dass das Peptid-Poloxamin-selbstorganisierende Nanopartikel-Abgabesystem (PP-sNp) die effiziente Transfektion von Nukleinsäuren in den Atemwegen von Mäusen vermitteln kann23. Das PP-sNp verfolgt einen multifunktionalen modularen Designansatz, der verschiedene Funktionsmodule in die Nanopartikel für ein schnelles Screening und Optimierung integrieren kann23. Die synthetischen Peptide und elektrisch neutralen amphiphilen Blockcopolymere (Poloxamin) innerhalb des PP-sNp können spontan mit IVT-mRNA interagieren, um gleichmäßig verteilte Nanopartikel mit kompakter Struktur und glatter Oberfläche zu erzeugen23. PP-sNp kann den Gentransfektionseffekt von IVT-mRNA-Molekülen in kultivierten Zellen und den Atemwegen von Mäusen verbessern23. Die vorliegende Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von PP-sNp mit IVT-mRNA, das Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) kodiert (Abbildung 1). In diesem Protokoll wird eine kontrollierte und schnelle Durchmischung über eine mikrofluidische Mischvorrichtung verwendet, die das versetzte Fischgrätenmischdesign verwendet. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Erzeugung von PP-sNp mit einheitlicheren Größen. Das allgemeine Ziel der PP-sNp-Produktion mit dem mikrofluidischen Mischer ist es, PP-sNp für die mRNA-Komplexierung auf gut kontrollierte Weise zu erzeugen und so eine effiziente und reproduzierbare Zelltransfektion in vitro zu ermöglichen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung, Montage und Charakterisierung von PP-sNp enthaltender MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht nicht nur die kostengünstige und schnelle Herstellung von IVT-mRNA-Impfstoffformulierungen mit definierten Eigenschaften, sondern bietet auch die Möglichkeit, die PP-sNp-Formulierung an spezifische therapeutische Zwecke, wie z.B. Gentherapie, anzupassen. Um die erfolgreiche Generierung von IVT mRNA/PP-sNp zu gewährleisten, wird empfohlen, einige kritische Schritte besonders zu beachten. Denken Sie bei der Arbeit mit mRNA immer daran, dass RNase-freie Bedingungen während des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), dem Großprojekt Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) des chinesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, dem Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) und der Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Xiaoyan Ding für die Messung des hydrodynamischen Durchmessers (nm) und des Polydispersitätsindex (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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