טרנספקציה יעילה של mRNA מתועתק במבחנה בתאים בתרבית באמצעות ננו-חלקיקים פפטיד-פולוקסאמין
Summary
ננו-חלקיק פפטיד-פולוקסאמין בהרכבה עצמית (PP-sNp) פותח באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי כדי לתמצת ולהעביר רנ”א שליח מתועתק במבחנה . ה-mRNA/PP-sNp המתואר יכול להעביר ביעילות תאים בתרבית במבחנה.
Abstract
חיסוני RNA שליח מתועתקים במבחנה (mRNA) הציגו פוטנציאל עצום במאבק במגפת הקורונה 2019 (COVID-19). מערכות אספקה יעילות ובטוחות חייבות להיכלל בחיסוני ה-mRNA בשל התכונות השבריריות של mRNA. מערכת העברת גנים של ננו-חלקיקי פפטיד-פולוקסאמין (PP-sNp) בהרכבה עצמית תוכננה במיוחד להעברה ריאתית של חומצות גרעין ומציגה יכולות מבטיחות בתיווך העברה מוצלחת של mRNA. כאן מתוארת שיטה משופרת להכנת PP-sNp כדי לפרט כיצד ה-PP-sNp עוטף את ה-mRNA של Metridia luciferase (MetLuc) ומעביר בהצלחה תאים בתרבית. MetLuc-mRNA מתקבל על ידי תהליך שעתוק במבחנה מתבנית DNA ליניארית. PP-sNp מיוצר על ידי ערבוב פפטיד/פולוקסאמין סינתטי עם תמיסת mRNA באמצעות מערבל מיקרופלואידי, המאפשר הרכבה עצמית של PP-sNp. המטען של PP-sNp מוערך לאחר מכן על ידי מדידת פוטנציאל הזטה. בינתיים, הפולידיספריות והגודל ההידרודינמי של ננו-חלקיקי PP-sNp נמדדים באמצעות פיזור אור דינמי. הננו-חלקיקים mRNA/PP-sNp מועברים לתאים בתרבית, וסופרנאטנטים מתרבית התאים נבדקים לפעילות לוציפראז. התוצאות המייצגות מדגימות את יכולתן להעברה חוץ-גופית. פרוטוקול זה עשוי לשפוך אור על פיתוח מערכות אספקת חיסוני mRNA מהדור הבא.
Introduction
החיסון הוכרז כאחת ההתערבויות הרפואיות היעילות ביותר להפחתת התחלואה והתמותה הנגרמות ממחלות זיהומיות1. חשיבות החיסונים הוכחה מאז פרוץ מחלת הקורונה 2019 (COVID-19). בניגוד לתפיסה המסורתית של הזרקת פתוגנים מומתים או מוחלשים, גישות חיסונים מתקדמות, כגון חיסונים מבוססי חומצות גרעין, מתרכזות בשימור התכונות הממריצות את מערכת החיסון של פתוגני המטרה תוך הימנעות מבעיות הבטיחות הפוטנציאליות הקשורות לנגיף המיקרוביאלי השלם הקונבנציונלי – או בחיסונים מבוססי חיידקים. הן חיסונים מבוססי דנ”א והן רנ”א (כלומר, רנ”א שליח מתועתק במבחנה, IVT mRNA) מציגים פוטנציאל מניעתי עד טיפולי נגד מגוון מחלות, כולל מחלות זיהומיות וסרטן 2,3. באופן עקרוני, הפוטנציאל של חיסונים מבוססי חומצות גרעין קשור לייצורם, יעילותם ובטיחותם4. חיסונים אלה יכולים להיות מיוצרים באופן ללא תאים כדי לאפשר ייצור חסכוני, מדרגי ומהיר.
חיסון יחיד המבוסס על חומצות גרעין יכול לקודד אנטיגנים מרובים, מה שמאפשר מטרה לווריאנטים נגיפיים רבים או חיידקים עם מספר מופחת של חיסונים ולחזק את התגובה החיסונית נגד פתוגנים עמידים 5,6. חוץ מזה, חיסונים המבוססים על חומצות גרעין יכולים לחקות את תהליך הפלישה הטבעי של זיהום נגיפי או חיידקי, ולהביא הן לתגובות חיסוניות בתיווך תאי B והן בתאי T. בניגוד לחלק מהחיסונים מבוססי הנגיפים או הדנ”א, חיסונים מבוססי IVT mRNA מציעים יתרון עצום מבחינת בטיחות. הם יכולים לבטא במהירות את האנטיגן הרצוי בציטוזול ואינם משולבים בגנום המארח, מה שמייתר את החששות לגבי מוטגנזה החדרתית7. IVT-mRNA מתפרק באופן אוטומטי לאחר תרגום מוצלח, כך שניתן לשלוט בקלות בקינטיקה של ביטוי החלבון שלו 8,9. על ידי מגיפת נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) של תסמונת נשימתית חריפה חמורה, מאמצים של חברות/מוסדות ברחבי העולם אפשרו שחרור לשוק של סוגים רבים של חיסונים. טכנולוגיית חיסון מבוססת mRNA IVT מראה פוטנציאל גדול, ולראשונה, הוכיחה את הצלחתה הצפויה בעבר, הודות לתכנון המהיר שלה ויכולתה הגמישה להסתגל לכל אנטיגן מטרה תוך מספר חודשים. ההצלחה של חיסוני mRNA IVT נגד COVID-19 ביישומים קליניים לא רק פתחה עידן חדש של מחקר ופיתוח חיסוני mRNA IVT, אלא גם צברה ניסיון רב ערך לפיתוח מהיר של חיסונים יעילים להתמודדות עם התפרצויות של מחלות זיהומיות10,11.
למרות הפוטנציאל המבטיח של חיסוני mRNA IVT, ההעברה התוך-תאית היעילה של mRNA IVT לאתר הפעולה (כלומר, ציטופלסמה) ממשיכה להוות מכשול גדול12, במיוחד עבור אלה הניתנים דרך דרכי הנשימה4. IVT mRNA היא מטבעה מולקולה לא יציבה עם זמן מחצית חיים קצר ביותר (~7 שעות)13, מה שהופך את ה-IVT mRNA לנוטה מאוד להתפרקות על ידי RNase14 הנמצא בכל מקום. הלימפוציטים של מערכת החיסון המולדת נוטים לבלוע את ה- mRNA המוכר של IVT במקרים של יישום in vivo . יתר על כן, צפיפות המטען השלילי הגבוהה והמשקל המולקולרי הגדול (1 x 104-1 x 106 Da) של mRNA IVT פוגעים בחדירתו היעילה על פני דו-שכבת השומנים האניונית של קרומי התאים15. לכן, נדרשת מערכת אספקה עם חומרים ביו-פונקציונליים מסוימים כדי לעכב את הפירוק של מולקולות ה-mRNA של IVT ולהקל על ספיגת התאים16.
מלבד כמה מקרים חריגים שבהם נעשה שימוש ישיר ב-mRNA IVT עירום לחקירות in vivo, נעשה שימוש במערכות אספקה שונות כדי לשאת את ה-IVT mRNA לאתר הטיפולי של פעולה17,18. מחקרים קודמים גילו כי רק כמה mRNA IVT מזוהים בציטוזול ללא סיוע של מערכת אספקה19. אסטרטגיות רבות פותחו כדי לשפר את אספקת ה-RNA במאמצים מתמשכים בתחום, החל מעיבוי פרוטמין ועד אנקפסולציה של שומנים20. ננו-חלקיקי ליפידים (LNPs) הם המתקדמים ביותר מבחינה קלינית מבין כלי ההעברה של mRNA, כפי שמוכיחה העובדה שכל חיסוני ה-mRNA COVID-19 המאושרים לשימוש קליני משתמשים במערכות אספקה מבוססות LNP21. עם זאת, LNPs אינם יכולים לתווך טרנספקציה יעילה של mRNA כאשר הפורמולציות מועברות דרך נתיב הנשימה22, מה שמגביל באופן מדהים את היישום של פורמולציות אלה בגרימת תגובות חיסוניות של הרירית או בטיפול במחלות הקשורות לריאתיות כגון סיסטיק פיברוזיס או מחסור ב-α1-antitrypsin. לכן, פיתוח מערכת אספקה חדשנית כדי להקל על אספקה יעילה והעברה של mRNA IVT בתאים הקשורים לדרכי הנשימה נדרש כדי לפתור את הצורך הבלתי מסופק הזה.
אושר כי מערכת העברת הננו-חלקיקים בהרכבה עצמית של פפטיד-פולוקסאמין (PP-sNp) יכולה לתווך את ההעברה היעילה של חומצות גרעין בדרכי הנשימה של עכברים23. PP-sNp מאמצת גישת תכנון מודולרי רב-תכליתית, שיכולה לשלב מודולים פונקציונליים שונים בננו-חלקיקים לצורך סינון ואופטימיזציה מהירים23. הפפטידים הסינתטיים וקופולימרים של בלוקים אמפיפיליים ניטרליים חשמלית (פולוקסאמין) בתוך PP-sNp יכולים לקיים אינטראקציה ספונטנית עם mRNA IVT כדי ליצור ננו-חלקיקים המפוזרים באופן אחיד עם מבנה קומפקטי ומשטח חלק23. PP-sNp יכול לשפר את השפעת הטרנספקציה הגנטית של מולקולות mRNA IVT בתאים בתרבית ובדרכי הנשימה של עכברים23. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול ליצירת PP-sNp המכיל mRNA IVT המקודד את Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (איור 1). בפרוטוקול זה נעשה שימוש בערבוב מבוקר ומהיר באמצעות מכשיר ערבוב מיקרופלואידי, המשתמש בעיצוב ערבוב עצמות הרינג המדשדש. ההליך קל לביצוע ומאפשר יצירת PP-sNp בגדלים אחידים יותר. המטרה הכללית של ייצור PP-sNp באמצעות מערבל מיקרופלואידי היא ליצור PP-sNp עבור קומפלקס mRNA באופן מבוקר היטב, ובכך לאפשר טרנספקציה יעילה וניתנת לשחזור של תאים במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההכנה, ההרכבה והאפיון של PP-sNp המכיל MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן לא רק מאפשר ייצור חסכוני ומהיר של פורמולציות חיסון IVT mRNA עם תכונות מוגדרות, אלא הוא גם מציע את האפשרות להתאים אישית את נוסחת PP-sNp בהתאם למטרות טיפוליות ספציפיות, כגון ריפוי גנטי. על מנת להבטיח את הדור המוצלח של IVT mRNA/PP-sNp, מומלץ להקדיש תשומת לב נוספת לכמה שלבים קריטיים. כאש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, מענק מס ‘82041045 ו- 82173764), הפרויקט הגדול של מחקר על פתוגנזה ומערכת טכנולוגיה למניעת מגיפות (2021YFC2302500) על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של סין, פרויקט הכישרונות הצעירים יוצאי הדופן של צ’ונגצ’ינג: כישרונות צעירים יוצאי דופן (CQYC202005027), והקרן למדעי הטבע של צ’ונגצ’ינג (cstc2021jcyj-msxmX0136). המחברים מודים לד”ר שיאויאן דינג על מדידת הקוטר ההידרודינמי (nm) ומדד הפולידיספרסיה (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
