ペプチドポロキサミンナノ粒子を用いた培養細胞における in vitro 転写mRNAの効率的なトランスフェクション
Summary
自己組織化ペプチドポロキサミンナノ粒子(PP-sNp)は、イン ビトロ転写 メッセンジャーRNAをカプセル化および送達するためにマイクロ流体混合装置を使用して開発される。記載されたmRNA/PP-sNpは、 インビトロで培養細胞を効率的にトランスフェクトすることができた。
Abstract
インビトロ転写 メッセンジャーRNA(mRNA)ワクチンは、コロナウイルス病2019(COVID-19)パンデミックとの戦いにおいて大きな可能性を示しています。mRNAの脆弱な特性のために、効率的で安全な送達システムをmRNAワクチンに含める必要があります。自己組織化ペプチドポロキサミンナノ粒子(PP-sNp)遺伝子送達システムは、核酸の肺送達のために特別に設計されており、成功したmRNAトランスフェクションを媒介する有望な能力を示す。ここでは、PP-sNpを調製するための改良された方法が記載されており、PP-sNpがメトリジアルシフェラーゼ(MetLuc)mRNAをカプセル化し、培養細胞をトランスフェクトする方法について詳述する。MetLuc-mRNAは、線状DNAテンプレートからの インビトロ 転写プロセスによって得られる。PP-sNpは、マイクロ流体ミキサーを用いて合成ペプチド/ポロキサミンとmRNA溶液を混合することにより製造され、PP-sNpの自己組織化を可能にする。PP−sNpの電荷は、その後、ゼータ電位を測定することによって評価される。一方、PP−sNpナノ粒子の多分散性および流体力学的サイズは、動的光散乱を用いて測定される。mRNA/PP-sNpナノ粒子を培養細胞にトランスフェクトし、培養細胞の上清をルシフェラーゼ活性についてアッセイする。代表的な結果は、 インビトロ トランスフェクションに対するそれらの能力を実証する。このプロトコルは、次世代mRNAワクチン送達システムの開発に光を当てる可能性があります。
Introduction
ワクチン接種は、感染症によって引き起こされる罹患率および死亡率を低下させるための最も効率的な医学的介入の1つとして予告されている1。ワクチンの重要性は、2019年のコロナウイルス病(COVID-19)の発生以来実証されています。不活化または弱毒化生病原体を注入するという従来の概念とは対照的に、核酸ベースのワクチンなどの最先端のワクチンアプローチは、従来の全微生物ウイルスまたは細菌ベースのワクチンに関連する潜在的な安全性の問題を回避しながら、標的病原体の免疫刺激特性を維持することに集中します。DNAおよびRNA(すなわち、 インビトロ転写 メッセンジャーRNA、IVT mRNA)ベースのワクチンは、感染症および癌を含む様々な疾患に対して予防的〜治療的可能性を示す2、3。原則として、核酸ベースのワクチンの可能性は、その生産、有効性、および安全性に関連しています4。これらのワクチンは、費用対効果が高く、スケーラブルで、迅速な生産を可能にするために、無細胞で製造することができます。
単一の核酸ベースのワクチンは、複数の抗原をコードすることができ、接種回数を減らして多数のウイルス変異体または細菌の標的を可能にし、弾力性病原体に対する免疫応答を強化する5,6。さらに、核酸ベースのワクチンは、ウイルスまたは細菌感染の自然な侵入プロセスを模倣し、B細胞およびT細胞媒介性免疫応答の両方をもたらす可能性がある。一部のウイルスまたはDNAベースのワクチンとは異なり、IVT mRNAベースのワクチンは安全性の面で大きな利点を提供します。それらは、細胞質ゾル中で所望の抗原を迅速に発現することができ、宿主ゲノムに組み込まれていないため、挿入突然変異誘発に関する懸念を排除する7。IVT-mRNAは翻訳が成功すると自動的に分解されるため、そのタンパク質発現動態は容易に制御できます8,9。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)のパンデミックに触媒され、世界中の企業/機関からの努力により、多くの種類のワクチンが市場にリリースされました。IVT mRNAベースのワクチン技術は大きな可能性を示し、その迅速な設計と数ヶ月以内にあらゆる標的抗原に適応する柔軟な能力により、初めて以前に期待されていた成功を実証しました。臨床応用におけるCOVID-19に対するIVT mRNAワクチンの成功は、IVT mRNAワクチンの研究開発の新時代を開いただけでなく、感染症の発生に対処するための効果的なワクチンの迅速な開発のための貴重な経験を蓄積しました10,11。
IVT mRNAワクチンの有望な可能性にもかかわらず、作用部位(すなわち、細胞質)へのIVT mRNAの効率的な細胞内送達は、特に気道を介して投与されるものに対して、引き続き大きなハードル12を提起している4。IVT mRNAは本質的に非常に短い半減期(〜7時間)13を持つ不安定な分子であり、IVT mRNAはユビキタスRNase14によって分解されやすい。自然免疫系のリンパ球は、in vivo適用の場合に認識されたIVT mRNAを飲み込む傾向がある。さらに、IVT mRNAの高い負電荷密度および大きな分子量(1 x104−1 x106Da)は、細胞膜15のアニオン性脂質二重層全体にわたるその効果的な透過を損なう。したがって、IVT mRNA分子の分解を阻害し、細胞の取り込みを促進するために、特定の生体機能材料を含む送達系が必要である16。
裸のIVT mRNAがインビボ調査に直接利用されたいくつかの例外的なケースを除いて、IVT mRNAを治療的作用部位に運ぶために様々な送達系が使用される17,18。以前の研究は、送達系の助けなしに細胞質ゾルにおいて検出されるIVT mRNAがごくわずかであることが明らかにされている19。RNA送達を改善するために、プロタミン縮合から脂質封入まで、この分野での継続的な努力により、数多くの戦略が開発されています20。脂質ナノ粒子(LNP)は、臨床使用のために承認されたすべてのmRNA COVID-19ワクチンがLNPベースの送達システムを採用しているという事実によって証明されるように、mRNA送達ビヒクルの中で最も臨床的に進歩している21。しかしながら、LNPは、製剤が呼吸経路22を介して送達される場合、効果的なmRNAトランスフェクションを媒介することができず、粘膜免疫応答を誘導すること、または嚢胞性線維症またはα1-アンチトリプシン欠乏症などの肺関連疾患に対処する際のこれらの製剤の適用を著しく制限する。したがって、気道関連細胞におけるIVT mRNAの効率的な送達およびトランスフェクションを容易にする新規送達システムの開発は、この満たされていない必要性を解決するために必要とされる。
ペプチドポロキサミン自己組織化ナノ粒子(PP−sNp)送達系が、マウス23の気道における核酸の効率的なトランスフェクションを媒介し得ることが確認されている。PP-sNpは、多機能モジュラー設計アプローチを採用しており、異なる機能モジュールをナノ粒子に統合して迅速なスクリーニングと最適化を行うことができます23。PP−sNp内の合成ペプチドおよび電気的に中性な両親媒性ブロックコポリマー(ポロキサミン)は、IVT mRNAと自発的に相互作用して、コンパクトな構造および平滑な表面を有する均一に分布したナノ粒子を生成することができる23。PP-sNpは、マウス23の培養細胞および気道におけるIVT mRNA分子の遺伝子導入効果を向上させることができる。本研究は、メトリジア・ルシフェラーゼ(MetLuc−mRNA)をコードするIVT mRNAを含むPP−sNpを生成するためのプロトコールを記載する(図1)。千鳥ヘリンボーン混合設計を採用したマイクロ流体混合装置 を介した 制御された迅速な混合は、このプロトコルで利用されています。この手順は実行が簡単で、より均一なサイズのPP-sNpを生成できます。マイクロ流体ミキサーを使用したPP-sNp生産の一般的な目標は、mRNA複合体形成のためのPP-sNpを十分に制御された方法で作成し、 インビトロでの効率的で再現性のある細胞トランスフェクションを可能にすることです。本プロトコールは、MetLuc−mRNAを含むPP−sNpの調製、組み立て、および特性評価を記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、定義された特性を有するIVT mRNAワクチン製剤の費用対効果が高く迅速な製造を可能にするだけでなく、遺伝子治療などの特定の治療目的に応じてPP-sNp製剤をカスタマイズする可能性も提供する。IVT mRNA/PP-sNpの生成を確実に成功させるために、いくつかの重要なステップに特別な注意を払うことが推奨されます。mRNAを扱うときは、IVT mRNAが化学修飾で調製されて?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC、Grant No. 82041045 and 82173764)、中国科学技術部による病因形成および伝染病予防技術システムに関する研究(2021YFC2302500)、重慶才能:例外的な若い才能プロジェクト(CQYC202005027)、重慶自然科学財団(cstc2021jcyj-msxmX0136)の支援を受けた。著者らは、流体力学的直径(nm)と多分散度指数(PDI)を測定したXiaoyan Ding博士に感謝している。
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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