Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina
Summary
Se desarrolla una nanopartícula de péptido-poloxamina autoensamblada (PP-sNp) utilizando un dispositivo de mezcla microfluídica para encapsular y entregar ARN mensajero transcrito in vitro . El ARNm/PP-sNp descrito podría transfectar eficientemente células cultivadas in vitro.
Abstract
Las vacunas de ARN mensajero transcritas in vitro (ARNm) han mostrado un enorme potencial en la lucha contra la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Los sistemas de administración eficientes y seguros deben incluirse en las vacunas de ARNm debido a las frágiles propiedades del ARNm. Un sistema de administración de genes de nanopartículas de péptido-poloxamina autoensamblado (PP-sNp) está diseñado específicamente para la administración pulmonar de ácidos nucleicos y muestra capacidades prometedoras para mediar la transfección exitosa de ARNm. Aquí, se describe un método mejorado para preparar PP-sNp para explicar cómo el PP-sNp encapsula el ARNm de Metridia luciferase (MetLuc) y transfecta con éxito las células cultivadas. El ARNm de MetLuc se obtiene mediante un proceso de transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN lineal. Un PP-sNp se produce mezclando péptido sintético / poloxamina con solución de ARNm utilizando un mezclador microfluídico, lo que permite el autoensamblaje de PP-sNp. La carga de PP-sNp se evalúa posteriormente midiendo el potencial zeta. Mientras tanto, la polidispersidad y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas de PP-sNp se miden utilizando dispersión dinámica de luz. Las nanopartículas de ARNm/PP-sNp se transfieren en células cultivadas, y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de la luciferasa. Los resultados representativos demuestran su capacidad de transfección in vitro. Este protocolo puede arrojar luz sobre el desarrollo de sistemas de administración de vacunas de ARNm de próxima generación.
Introduction
La vacunación ha sido anunciada como una de las intervenciones médicas más eficientes para reducir la morbilidad y mortalidad causadas por enfermedades infecciosas1. La importancia de las vacunas se ha demostrado desde el brote de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). A diferencia del concepto tradicional de inyectar patógenos inactivados o vivos atenuados, los enfoques de vacunas de última generación, como las vacunas basadas en ácidos nucleicos, se concentran en preservar las propiedades inmunoestimulantes de los patógenos objetivo al tiempo que evitan los posibles problemas de seguridad asociados con el virus microbiano completo convencional o en las vacunas basadas en bacterias. Tanto las vacunas basadas en ADN como en ARN (es decir, ARN mensajero transcrito in vitro, ARNm IVT) exhiben potencial profiláctico a terapéutico contra una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades infecciosas y los cánceres 2,3. En principio, el potencial de las vacunas basadas en ácidos nucleicos se relaciona con su producción, eficacia y seguridad4. Estas vacunas se pueden fabricar de manera libre de células para permitir una producción rentable, escalable y rápida.
Una sola vacuna basada en ácidos nucleicos puede codificar múltiples antígenos, permitiendo el objetivo de numerosas variantes virales o bacterias con un número reducido de inoculaciones y fortaleciendo la respuesta inmune contra patógenos resilientes 5,6. Además, las vacunas basadas en ácidos nucleicos podrían imitar el proceso de invasión natural de la infección bacteriana o de virus, trayendo respuestas inmunes mediadas por células B y células T. A diferencia de algunas vacunas basadas en virus o en ADN, las vacunas basadas en ARNm IVT ofrecen una gran ventaja en términos de seguridad. Pueden expresar rápidamente el antígeno deseado en el citosol y no están integrados en el genoma del huésped, evitando las preocupaciones sobre la mutagénesis de inserción7. El ARNm de IVT se degrada automáticamente después de una traducción exitosa, por lo que su cinética de expresión de proteínas se puede controlar fácilmente 8,9. Catalizados por la pandemia del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), los esfuerzos de empresas / instituciones de todo el mundo han permitido el lanzamiento al mercado de muchos tipos de vacunas. La tecnología de vacunas basada en ARNm IVT muestra un gran potencial y, por primera vez, ha demostrado su éxito previamente anticipado, debido a su diseño rápido y capacidad flexible para adaptarse a cualquier antígeno objetivo en varios meses. El éxito de las vacunas de ARNm IVT contra COVID-19 en aplicaciones clínicas no solo abrió una nueva era de investigación y desarrollo de vacunas de ARNm IVT, sino que también acumuló una valiosa experiencia para el rápido desarrollo de vacunas efectivas para tratar brotes de enfermedades infecciosas10,11.
A pesar del potencial prometedor de las vacunas de ARNm IVT, la entrega intracelular eficiente de ARNm IVT al sitio de acción (es decir, citoplasma) continúa planteando un obstáculo importante12, especialmente para aquellos administrados a través de las vías respiratorias4. El ARNm de IVT es inherentemente una molécula inestable con una vida media extremadamente corta (~ 7 h)13, lo que hace que el ARNm de IVT sea altamente propenso a la degradación por la ubicua RNasa14. Los linfocitos del sistema inmune innato tienden a engullir el ARNm IVT reconocido en casos de aplicación in vivo . Además, la alta densidad de carga negativa y el gran peso molecular (1 x 104-1 x 106 Da) del ARNm de IVT perjudican su permeación efectiva a través de la bicapa lipídica aniónica de las membranas celulares15. Por lo tanto, se requiere un sistema de administración con ciertos materiales biofuncionales para inhibir la degradación de las moléculas de ARNm de IVT y facilitar la absorción celular16.
Aparte de algunos casos excepcionales en los que el ARNm de la IVT desnuda fue utilizado directamente para investigaciones in vivo, se utilizan varios sistemas de administración para llevar el ARNm de la IVT al sitio terapéutico de acción17,18. Estudios previos han revelado que sólo unos pocos ARNm IVT son detectados en el citosol sin la ayuda de un sistema de administración19. Se han desarrollado numerosas estrategias para mejorar la entrega de ARN con esfuerzos continuos en el campo, que van desde la condensación de protamina hasta la encapsulación lipídica20. Las nanopartículas lipídicas (PNL) son las más avanzadas clínicamente entre los vehículos de administración de ARNm, como lo demuestra el hecho de que todas las vacunas COVID-19 de ARNm aprobadas para uso clínico emplean sistemas de administración basados en PNL21. Sin embargo, los LNP no pueden mediar la transfección efectiva del ARNm cuando las formulaciones se administran por vía respiratoria22, lo que limita notablemente la aplicación de estas formulaciones para inducir respuestas inmunes de la mucosa o abordar enfermedades relacionadas con la pulmón, como la fibrosis quística o la deficiencia de α1-antitripsina. Por lo tanto, se requiere desarrollar un nuevo sistema de administración para facilitar la administración y transfección eficientes del ARNm de IVT en células relacionadas con las vías respiratorias para resolver esta necesidad no satisfecha.
Se ha confirmado que el sistema de entrega de nanopartículas autoensambladas de péptido-poloxamina (PP-sNp) puede mediar la transfección eficiente de ácidos nucleicos en el tracto respiratorio de ratones23. El PP-sNp adopta un enfoque de diseño modular multifuncional, que puede integrar diferentes módulos funcionales en las nanopartículas para una rápida detección y optimización23. Los péptidos sintéticos y los copolímeros de bloque anfifílico eléctricamente neutros (poloxamina) dentro del PP-sNp pueden interactuar espontáneamente con el ARNm de IVT para generar nanopartículas distribuidas uniformemente con una estructura compacta y superficie lisa23. PP-sNp puede mejorar el efecto de transfección génica de las moléculas de ARNm de IVT en células cultivadas y el tracto respiratorio de ratones23. El presente estudio describe un protocolo para generar PP-sNp que contiene ARNm IVT que codifica Metridia luciferasa (MetLuc-mRNA) (Figura 1). En este protocolo se utiliza una mezcla controlada y rápida a través de un dispositivo de mezcla microfluídica, que emplea el diseño de mezcla escalonada en espiga. El procedimiento es fácil de ejecutar y permite la generación de PP-sNp con tamaños más uniformes. El objetivo general de la producción de PP-sNp utilizando el mezclador microfluídico es crear PP-sNp para la complejación de ARNm de una manera bien controlada, permitiendo así una transfección celular eficiente y reproducible in vitro. El presente protocolo describe la preparación, ensamblaje y caracterización de PP-sNp que contiene MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí no solo permite la producción rentable y rápida de formulaciones de vacunas de ARNm IVT con propiedades definidas, sino que también ofrece la posibilidad de personalizar la formulación de PP-sNp de acuerdo con fines terapéuticos específicos, como la terapia génica. Con el fin de garantizar la generación exitosa de ARNm / PP-sNp IVT, se sugiere prestar especial atención a algunos pasos críticos. Cuando trabaje con ARNm, recuerde siempre que las condiciones libres de RNasa deben manten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, Subvención No. 82041045 y 82173764), el principal proyecto de Estudio sobre el Sistema de Tecnología de Patogénesis y Prevención de Epidemias (2021YFC2302500) por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China, el Proyecto Chongqing Talents: Exceptional Young Talents (CQYC202005027) y la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Los autores agradecen al Dr. Xiaoyan Ding por medir el diámetro hidrodinámico (nm) y el índice de polidispersidad (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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