Effektiv transfektion af in vitro transkriberet mRNA i dyrkede celler ved hjælp af peptid-poloxamin nanopartikler
Summary
En selvsamlet peptid-poloxamin nanopartikel (PP-sNp) er udviklet ved hjælp af en mikrofluidisk blandeanordning til at indkapsle og levere in vitro transkriberet messenger RNA. Det beskrevne mRNA/PP-sNp kunne effektivt transfektere dyrkede celler in vitro.
Abstract
In vitro transskriberede messenger RNA (mRNA) vacciner har vist et enormt potentiale i kampen mod coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) pandemi. Effektive og sikre leveringssystemer skal inkluderes i mRNA -vaccinerne på grund af mRNA’s skrøbelige egenskaber. Et selvsamlet peptid-poloxamin nanopartikel (PP-sNp) genleveringssystem er specielt designet til lungelevering af nukleinsyrer og viser lovende evner til formidling af vellykket mRNA-transfektion. Her beskrives en forbedret metode til fremstilling af PP-sNp for at uddybe, hvordan PP-sNp indkapsler Metridia luciferase (MetLuc) mRNA og med succes transfekterer dyrkede celler. MetLuc-mRNA opnås ved en in vitro transkriptionsproces fra en lineær DNA-skabelon. En PP-sNp fremstilles ved at blande syntetisk peptid / poloxamin med mRNA-opløsning ved anvendelse af en mikrofluidisk mixer, hvilket muliggør selvmontering af PP-sNp. Ladningen af PP-sNp evalueres efterfølgende ved at måle zetapotentialet. I mellemtiden måles polydispersiteten og den hydrodynamiske størrelse af PP-sNp nanopartikler ved hjælp af dynamisk lysspredning. mRNA /PP-sNp nanopartikler transficeret til dyrkede celler, og supernatanter fra cellekulturen analyseres for luciferaseaktivitet. De repræsentative resultater viser deres kapacitet til in vitro-transfektion . Denne protokol kan kaste lys over udviklingen af næste generations mRNA-vaccineleveringssystemer.
Introduction
Vaccination er blevet udråbt som en af de mest effektive medicinske interventioner til at reducere sygelighed og dødelighed forårsaget af infektionssygdomme1. Betydningen af vacciner er blevet demonstreret siden udbruddet af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19). I modsætning til det traditionelle koncept med injektion af inaktiverede eller levende svækkede patogener koncentrerer state-of-the-art vaccinemetoder, såsom nukleinsyrebaserede vacciner, sig om at bevare målpatogenernes immunstimulerende egenskaber, samtidig med at man undgår de potentielle sikkerhedsproblemer forbundet med den konventionelle hele mikrobielle virus eller i bakteriebaserede vacciner. Både DNA- og RNA-baserede vacciner (dvs. in vitro transskriberet messenger RNA, IVT mRNA) udviser profylaktisk til terapeutisk potentiale mod en række sygdomme, herunder infektionssygdomme og kræft 2,3. I princippet vedrører potentialet i nukleinsyrebaserede vacciner deres produktion, effektivitet og sikkerhed4. Disse vacciner kan fremstilles på en cellefri måde for at muliggøre omkostningseffektiv, skalerbar og hurtig produktion.
En enkelt nukleinsyrebaseret vaccine kan kode for flere antigener, hvilket muliggør målet for adskillige virale varianter eller bakterier med et reduceret antal podninger og styrker immunresponset mod modstandsdygtige patogener 5,6. Desuden kan nukleinsyrebaserede vacciner efterligne den naturlige invasionsproces af virus eller bakteriel infektion, hvilket bringer både B-celle- og T-cellemedierede immunresponser. I modsætning til nogle virus- eller i DNA-baserede vacciner tilbyder IVT mRNA-baserede vacciner en enorm fordel med hensyn til sikkerhed. De kan hurtigt udtrykke det ønskede antigen i cytosolen og er ikke integreret i værtsgenomet, hvilket undgår bekymringer om insertional mutagenese7. IVT-mRNA nedbrydes automatisk efter vellykket translation, så dets proteinekspressionskinetik let kan kontrolleres 8,9. Katalyseret af den alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi har indsats fra virksomheder / institutioner over hele verden gjort det muligt at frigive til markedet af mange typer vacciner. Ivt mRNA-baseret vaccineteknologi viser et stort potentiale og har for første gang demonstreret sin tidligere forventede succes på grund af dens hurtige design og fleksible kapacitet til at tilpasse sig alle målantigener inden for flere måneder. Succesen med IVT mRNA-vacciner mod COVID-19 i kliniske applikationer åbnede ikke kun en ny æra inden for IVT mRNA-vaccineforskning og -udvikling, men akkumulerede også værdifuld erfaring til hurtig udvikling af effektive vacciner til håndtering af udbrud af infektionssygdomme10,11.
På trods af det lovende potentiale for IVT mRNA-vacciner udgør den effektive intracellulære levering af IVT-mRNA til virkningsstedet (dvs. cytoplasma) fortsat en stor hindring12, især for dem, der administreres via luftvejene4. IVT mRNA er i sagens natur et ustabilt molekyle med en ekstremt kort halveringstid (~ 7 h) 13, hvilket gør IVT mRNA meget tilbøjelig til nedbrydning af den allestedsnærværende RNase14. Lymfocytterne i det medfødte immunsystem har tendens til at opsluge det anerkendte IVT-mRNA i tilfælde af in vivo-applikation . Desuden forringer den høje negative ladningstæthed og den store molekylvægt (1 x 104-1 x 106 Da) af IVT mRNA dens effektive gennemtrængning over det anioniske lipiddobbeltlag af cellulære membraner15. Derfor kræves et leveringssystem med visse biofunktionelle materialer for at hæmme nedbrydningen af IVT-mRNA-molekylerne og lette cellulær optagelse16.
Bortset fra nogle få undtagelsestilfælde, hvor nøgen IVT mRNA blev direkte anvendt til in vivo-undersøgelser, anvendes forskellige leveringssystemer til at transportere IVT-mRNA til det terapeutiske virkningssted17,18. Tidligere undersøgelser har vist, at kun få IVT mRNA’er detekteres i cytosol uden hjælp fra et leveringssystem19. Talrige strategier er blevet udviklet til at forbedre RNA-levering med kontinuerlig indsats på området, lige fra protaminkondensation til lipidindkapsling20. Lipidnanopartikler (LNP’er) er de mest klinisk avancerede blandt mRNA-leveringskøretøjerne, hvilket bevises af, at alle de godkendte mRNA COVID-19-vacciner til klinisk brug anvender LNP-baserede leveringssystemer21. LNP’er kan imidlertid ikke formidle effektiv mRNA-transfektion, når formuleringerne leveres via respiratorisk rute22, hvilket bemærkelsesværdigt begrænser anvendelsen af disse formuleringer til at inducere slimhindeimmunrespons eller adressere lungerelaterede sygdomme såsom cystisk fibrose eller α1-antitrypsinmangel. Derfor er det nødvendigt at udvikle et nyt leveringssystem for at lette effektiv levering og transfektion af IVT mRNA i luftvejsrelaterede celler for at løse dette uopfyldte behov.
Det er blevet bekræftet, at peptid-poloxamin selvsamlede nanopartikel (PP-sNp) leveringssystem kan formidle den effektive transfektion af nukleinsyrer i luftvejene hos mus23. PP-sNp anvender en multifunktionel modulær designtilgang, som kan integrere forskellige funktionelle moduler i nanopartiklerne til hurtig screening og optimering23. De syntetiske peptider og elektrisk neutrale amfifile blokcopolymerer (poloxamin) i PP-sNp kan spontant interagere med IVT mRNA for at generere ensartet fordelte nanopartikler med en kompakt struktur og glat overflade23. PP-sNp kan forbedre gentransfektionseffekten af IVT mRNA-molekyler i dyrkede celler og luftvejene hos mus23. Denne undersøgelse beskriver en protokol til generering af PP-sNp indeholdende IVT mRNA, der koder for Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrolleret og hurtig blanding via en mikrofluidisk blandeanordning, der anvender det forskudte sildebensblandingsdesign, anvendes i denne protokol. Proceduren er let at udføre og tillader generering af PP-sNp med mere ensartede størrelser. Det generelle mål med PP-sNp-produktion ved hjælp af den mikrofluidiske mixer er at skabe PP-sNp til mRNA-kompleksdannelse på en velkontrolleret måde, hvilket muliggør effektiv og reproducerbar celletransfektion in vitro. Den nuværende protokol beskriver forberedelse, samling og karakterisering af PP-sNp indeholdende MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her tillader ikke kun omkostningseffektiv og hurtig produktion af IVT mRNA-vaccineformuleringer med definerede egenskaber, men den giver også mulighed for at tilpasse PP-sNp-formuleringen i henhold til specifikke terapeutiske formål, såsom genterapi. For at sikre en vellykket generering af IVT mRNA / PP-sNp foreslås det at være ekstra opmærksom på nogle kritiske trin. Når du arbejder med mRNA, skal du altid huske, at RNase-fri betingelser skal opretholdes gennem hele processen, fordi IVT mRN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), det store projekt study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) af Kinas Ministerium for Videnskab og Teknologi, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) og Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Forfatterne er taknemmelige for Dr. Xiaoyan Ding for at måle den hydrodynamiske diameter (nm) og polydispersitetsindekset (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
