पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोकणों का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड एमआरएनए का कुशल अभिकर्मक
Summary
इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए को समाहित करने और वितरित करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस का उपयोग करके एक स्व-इकट्ठे पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) विकसित किया गया है। वर्णित एमआरएनए / पीपी-एसएनपी इन विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक स्थानांतरित कर सकता है।
Abstract
इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) टीकों ने कोरोनोवायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी के खिलाफ लड़ने में भारी क्षमता प्रदर्शित की है। एमआरएनए के नाजुक गुणों के कारण एमआरएनए टीकों में कुशल और सुरक्षित वितरण प्रणालियों को शामिल किया जाना चाहिए। एक स्व-इकट्ठे पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) जीन वितरण प्रणाली विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड के फुफ्फुसीय वितरण के लिए डिज़ाइन की गई है और सफल एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता में आशाजनक क्षमताओं को प्रदर्शित करती है। यहां, पीपी-एसएनपी तैयार करने के लिए एक बेहतर विधि का वर्णन यह बताने के लिए किया गया है कि पीपी-एसएनपी मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक) एमआरएनए को कैसे समाहित करता है और सफलतापूर्वक सुसंस्कृत कोशिकाओं को स्थानांतरित करता है। मेटलुक-एमआरएनए एक रैखिक डीएनए टेम्पलेट से इन विट्रो प्रतिलेखन प्रक्रिया द्वारा प्राप्त किया जाता है। पोलोक्सामाइन को माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके एमआरएनए समाधान के साथ मिलाकर उत्पादित किया जाता है, जिससे पीपी-एसएनपी की आत्म-असेंबली की अनुमति मिलती है। पीपी-एसएनपी के चार्ज का मूल्यांकन बाद में जीटा क्षमता को मापकर किया जाता है। इस बीच, पीपी-एसएनपी नैनोकणों के पॉलीडिस्पर्सिटी और हाइड्रोडायनामिक आकार को गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके मापा जाता है। पीपी-एसएनपी नैनोकणों को सुसंस्कृत कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है, और सेल संस्कृति से सतह पर तैरनेवालों को लूसिफेरेज़ गतिविधि के लिए परख किया जाता है। प्रतिनिधि परिणाम इन विट्रो अभिकर्मक के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। यह प्रोटोकॉल अगली पीढ़ी के एमआरएनए वैक्सीन वितरण प्रणालियों को विकसित करने पर प्रकाश डाल सकता है।
Introduction
संक्रामक रोगों के कारण होने वाली रुग्णता और मृत्यु दर को कम करने के लिए टीकाकरण को सबसे कुशल चिकित्सा हस्तक्षेपों में से एक के रूप में घोषित किया गयाहै। कोरोना वायरस बीमारी 2019 (कोविड-19) के प्रकोप के बाद से टीकों के महत्व को प्रदर्शित किया गया है। निष्क्रिय या जीवित-क्षीण रोगजनकों को इंजेक्शन लगाने की पारंपरिक अवधारणा के विपरीत, अत्याधुनिक वैक्सीन दृष्टिकोण, जैसे न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीके, पारंपरिक संपूर्ण-माइक्रोबियल वायरस से जुड़े संभावित सुरक्षा मुद्दों से बचते हुए लक्ष्य रोगजनकों के प्रतिरक्षा-उत्तेजक गुणों को संरक्षित करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं- या बैक्टीरिया-आधारित टीकों में। डीएनए- और आरएनए दोनों (यानी, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए, आईवीटी एमआरएनए) -आधारित टीके संक्रामक रोगों और कैंसर 2,3 सहित विभिन्न बीमारियों के खिलाफ चिकित्सीय क्षमता के लिए रोगनिरोधी प्रदर्शन करते हैं। सिद्धांत रूप में, न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीकों की क्षमता उनके उत्पादन, प्रभावकारिता और सुरक्षा से संबंधितहै 4. इन टीकों को लागत प्रभावी, स्केलेबल और तेजी से उत्पादन की अनुमति देने के लिए सेल-मुक्त तरीके से निर्मित किया जा सकता है।
एक एकल न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीका कई एंटीजन को एन्कोड कर सकता है, जिससे टीकाकरण की कम संख्या के साथ कई वायरल वेरिएंट या बैक्टीरिया के लक्ष्य को सक्षम किया जा सकता है और लचीला रोगजनकों 5,6 के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मजबूत किया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूक्लिक एसिड-आधारित टीके वायरस या जीवाणु संक्रमण की प्राकृतिक आक्रमण प्रक्रिया की नकल कर सकते हैं, जिससे बी सेल- और टी सेल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं दोनों आती हैं। कुछ वायरस के विपरीत- या डीएनए-आधारित टीकों में, आईवीटी एमआरएनए-आधारित टीके सुरक्षा के मामले में एक बड़ा लाभ प्रदान करते हैं। वे साइटोसोल में वांछित एंटीजन को तेजी से व्यक्त कर सकते हैं और मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं होते हैं, सम्मिलन उत्परिवर्तन7 के बारे में चिंताओं को दूर करते हैं। सफल अनुवाद के बाद आईवीटी-एमआरएनए स्वचालित रूप से अपमानित हो जाता है, इसलिए इसकी प्रोटीन अभिव्यक्ति कैनेटीक्स को आसानी से 8,9 नियंत्रित किया जा सकता है। सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) महामारी से प्रेरित, दुनिया भर में कंपनियों/संस्थानों के प्रयासों ने कई प्रकार के टीकों के बाजार में रिलीज को सक्षम किया है। आईवीटी एमआरएनए-आधारित वैक्सीन तकनीक बड़ी क्षमता दिखाती है और पहली बार, इसकी तेजी से डिजाइन और कई महीनों के भीतर किसी भी लक्ष्य एंटीजन के अनुकूल होने की लचीली क्षमता के कारण, इसकी पहले से प्रत्याशित सफलता का प्रदर्शन किया है। नैदानिक अनुप्रयोगों में कोविड-19 के खिलाफ आईवीटी एमआरएनए टीकों की सफलता ने न केवल आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन अनुसंधान और विकास के एक नए युग की शुरुआत की, बल्कि संक्रामक रोगों के प्रकोप से निपटने के लिए प्रभावी टीकों के तेजी से विकास के लिए मूल्यवान अनुभव भी संचितकिया।
आईवीटी एमआरएनए टीकों की आशाजनक क्षमता के बावजूद, कार्रवाई की साइट (यानी, साइटोप्लाज्म) के लिए आईवीटी एमआरएनए की कुशल इंट्रासेल्युलर डिलीवरी एक बड़ी बाधा12 पैदा करना जारी रखती है, खासकर वायुमार्ग4 के माध्यम से प्रशासित लोगों के लिए। आईवीटी एमआरएनए स्वाभाविक रूप से एक अत्यंत कम आधा जीवन (~ 7 एच) 13 के साथ एक अस्थिर अणु है, जो आईवीटी एमआरएनए को सर्वव्यापी आरएनएएसई14 द्वारा गिरावट के लिए अत्यधिक प्रवण बनाता है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के लिम्फोसाइट्स विवो अनुप्रयोग के मामलों में मान्यता प्राप्त आईवीटी एमआरएनए को घेर लेते हैं। इसके अलावा, आईवीटी एमआरएनए के उच्च नकारात्मक चार्ज घनत्व और बड़े आणविक भार (1 एक्स 104-1 एक्स 106 डीए) सेलुलर झिल्ली15 के आयनिक लिपिड बाइलेयर में इसके प्रभावी पारगम्यता को खराब करते हैं। इसलिए, आईवीटी एमआरएनए अणुओं के क्षरण को रोकने और सेलुलर अपटेक16 की सुविधा के लिए कुछ जैव-कार्यात्मक सामग्रियों के साथ एक वितरण प्रणाली की आवश्यकता होती है।
कुछ असाधारण मामलों के अलावा जिसमें नग्न आईवीटी एमआरएनए का उपयोग सीधे विवो जांच के लिए किया गया था, विभिन्न वितरण प्रणालियों का उपयोग आईवीटी एमआरएनए को कार्रवाई17,18 की चिकित्सीय साइट पर ले जाने के लिए किया जाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डिलीवरी सिस्टम19 की सहायता के बिना साइटोसोल में केवल कुछ आईवीटी एमआरएनए का पता लगाया जाता है। प्रोटामाइन संक्षेपण से लिपिड एनकैप्सुलेशन20 तक क्षेत्र में निरंतर प्रयासों के साथ आरएनए वितरण में सुधार के लिए कई रणनीतियां विकसित की गई हैं। लिपिड नैनोपार्टिकल्स (एलएनपी) एमआरएनए डिलीवरी वाहनों में सबसे नैदानिक रूप से उन्नत हैं, जैसा कि इस तथ्य से साबित होता है कि नैदानिक उपयोग के लिए सभी अनुमोदित एमआरएनए कोविड -19 टीके एलएनपी-आधारित वितरण प्रणालियोंको नियोजित करते हैं। हालांकि, एलएनपी प्रभावी एमआरएनए अभिकर्मक की मध्यस्थता नहीं कर सकते हैं जब योगों को श्वसन मार्ग22 के माध्यम से वितरित किया जाता है, जो श्लेष्म प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने या फुफ्फुसीय से संबंधित बीमारियों जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस या α1-एंटीट्रिप्सिन की कमी को संबोधित करने में इन योगों के आवेदन को उल्लेखनीय रूप से सीमित करता है। इसलिए, वायुमार्ग से संबंधित कोशिकाओं में आईवीटी एमआरएनए के कुशल वितरण और अभिकर्मक को सुविधाजनक बनाने के लिए एक उपन्यास वितरण प्रणाली विकसित करना इस अपूर्ण आवश्यकता को हल करने के लिए आवश्यक है।
यह पुष्टि की गई है कि पेप्टाइड-पोलोक्सामाइन स्व-इकट्ठे नैनोपार्टिकल (पीपी-एसएनपी) वितरण प्रणाली चूहों के श्वसन पथ में न्यूक्लिक एसिड के कुशल अभिकर्मक की मध्यस्थता कर सकतीहै 23. पीपी-एसएनपी एक बहुआयामी मॉड्यूलर डिजाइन दृष्टिकोण को गोद लेता है, जो तेजी से स्क्रीनिंग और अनुकूलन23 के लिए नैनोकणों में विभिन्न कार्यात्मक मॉड्यूल को एकीकृत कर सकता है। पीपी-एसएनपी के भीतर सिंथेटिक पेप्टाइड्स और विद्युत रूप से तटस्थ एम्फीफिलिक ब्लॉक कॉपोलिमर (पोलोक्सामाइन) एक कॉम्पैक्ट संरचना और चिकनी सतह23 के साथ समान रूप से वितरित नैनोकणों को उत्पन्न करने के लिए आईवीटी एमआरएनए के साथ अनायास बातचीत कर सकते हैं। पीपी-एसएनपी सुसंस्कृत कोशिकाओं में आईवीटी एमआरएनए अणुओं के जीन अभिकर्मक प्रभाव और चूहों के श्वसन पथ में सुधार कर सकताहै 23. वर्तमान अध्ययन में आईपीटी एमआरएनए युक्त पीपी-एसएनपी उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो मेट्रिडिया ल्यूसिफेरेज़ (मेटलुक-एमआरएनए) (चित्रा 1) को एन्कोड करता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सिंग डिवाइस के माध्यम से नियंत्रित और तेजी से मिश्रण, जो कंपित हेरिंगबोन मिश्रण डिजाइन को नियोजित करता है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। प्रक्रिया निष्पादित करना आसान है और अधिक समान आकार के साथ पीपी-एसएनपी की पीढ़ी की अनुमति देता है। माइक्रोफ्लुइडिक मिक्सर का उपयोग करके पीपी-एसएनपी उत्पादन का सामान्य लक्ष्य एक अच्छी तरह से नियंत्रित तरीके से एमआरएनए जटिलता के लिए पीपी-एसएनपी बनाना है, इस प्रकार इन विट्रो में कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल अभिकर्मक की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल मेटलुक-एमआरएनए युक्त पीपी-एसएनपी की तैयारी, असेंबली और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल न केवल परिभाषित गुणों के साथ आईवीटी एमआरएनए वैक्सीन योगों के लागत प्रभावी और तेजी से उत्पादन की अनुमति देता है, बल्कि यह जीन थेरेपी जैसे विशिष्ट चिकित्सीय उद्देश्यों के अनुसार ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी, ग्रांट नंबर 82041045 और 82173764) द्वारा समर्थित किया गया था, जो चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा रोगजनन और महामारी रोकथाम प्रौद्योगिकी प्रणाली (2021वाईएफसी 2302500) पर अध्ययन की प्रमुख परियोजना, चोंगकिंग प्रतिभा: असाधारण युवा प्रतिभा परियोजना (सीक्यूवाईसी 202005027), और चोंगकिंग के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सीएसटीसी 202020202027) द्वारा समर्थित थी। लेखक हाइड्रोडायनामिक व्यास (एनएम) और पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) को मापने के लिए डॉ जियाओयन डिंग के आभारी हैं।
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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