Effektiv transfeksjon av in vitro transkribert mRNA i dyrkede celler ved bruk av peptid-poloksamin nanopartikler
Summary
En selvmontert peptid-poloxamin nanopartikkel (PP-sNp) er utviklet ved hjelp av en mikrofluidisk blandingsanordning for å innkapsle og levere in vitro transkribert messenger RNA. Det beskrevne mRNA/PP-sNp kunne effektivt transfektere dyrkede celler in vitro.
Abstract
In vitro transkriberte messenger RNA (mRNA) vaksiner har vist enormt potensial i kampen mot koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemi. Effektive og sikre leveringssystemer må inkluderes i mRNA-vaksinene på grunn av de skjøre egenskapene til mRNA. Et selvmontert peptid-poloxamin nanopartikkel (PP-sNp) genleveringssystem er spesielt utviklet for lungelevering av nukleinsyrer og viser lovende evner til å formidle vellykket mRNA-transfeksjon. Her beskrives en forbedret metode for fremstilling av PP-sNp for å utdype hvordan PP-sNp innkapsler Metridia luciferase (MetLuc) mRNA og vellykket transfekterer dyrkede celler. MetLuc-mRNA oppnås ved en in vitro transkripsjonsprosess fra en lineær DNA-mal. En PP-sNp produseres ved å blande syntetisk peptid / poloxamin med mRNA-løsning ved hjelp av en mikrofluidisk mikser, noe som muliggjør selvmontering av PP-sNp. Ladningen av PP-sNp evalueres deretter ved å måle zetapotensialet. I mellomtiden måles polydispersiteten og den hydrodynamiske størrelsen på PP-sNp nanopartikler ved hjelp av dynamisk lysspredning. mRNA / PP-sNp nanopartikler overføres til dyrkede celler, og supernatanter fra cellekulturen analyseres for luciferaseaktivitet. De representative resultatene viser deres evne til in vitro transfeksjon. Denne protokollen kan kaste lys over utviklingen av neste generasjons mRNA-vaksineleveringssystemer.
Introduction
Vaksinasjon har blitt varslet som et av de mest effektive medisinske tiltakene for å redusere sykelighet og dødelighet forårsaket av smittsomme sykdommer1. Betydningen av vaksiner har blitt demonstrert siden utbruddet av koronavirussykdom 2019 (COVID-19). I motsetning til det tradisjonelle konseptet med å injisere inaktiverte eller levende svekkede patogener, konsentrerer toppmoderne vaksinetilnærminger, for eksempel nukleinsyrebaserte vaksiner, seg om å bevare de immunstimulerende egenskapene til målpatogenene, samtidig som man unngår de potensielle sikkerhetsproblemene forbundet med konvensjonelle helmikrobielle virus- eller i bakteriebaserte vaksiner. Både DNA- og RNA (dvs. in vitro-transkriberte messenger RNA, IVT mRNA)-baserte vaksiner utviser profylaktisk til terapeutisk potensial mot en rekke sykdommer, inkludert smittsomme sykdommer og kreft 2,3. I prinsippet er potensialet til nukleinsyrebaserte vaksiner relatert til produksjon, effekt og sikkerhet4. Disse vaksinene kan produseres på en cellefri måte for å muliggjøre kostnadseffektiv, skalerbar og rask produksjon.
En enkelt nukleinsyrebasert vaksine kan kode flere antigener, noe som muliggjør målet for mange virusvarianter eller bakterier med redusert antall inokulasjoner og styrker immunresponsen mot motstandsdyktige patogener 5,6. Dessuten kan nukleinsyrebaserte vaksiner etterligne den naturlige invasjonsprosessen av virus eller bakteriell infeksjon, og bringe både B-celle- og T-cellemedierte immunresponser. I motsetning til noen virus- eller i DNA-baserte vaksiner, gir IVT mRNA-baserte vaksiner en stor fordel når det gjelder sikkerhet. De kan raskt uttrykke det ønskede antigenet i cytosolen og er ikke integrert i vertsgenomet, og unngår bekymringer for innsettingsmutagenese7. IVT-mRNA nedbrytes automatisk etter vellykket oversettelse, slik at proteinuttrykkskinetikken lett kan kontrolleres 8,9. Katalysert av den alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi, har innsats fra bedrifter / institusjoner over hele verden muliggjort utgivelsen til markedet for mange typer vaksiner. IVT mRNA-basert vaksineteknologi viser stort potensial og har for første gang vist sin tidligere forventede suksess, på grunn av sin raske design og fleksible kapasitet til å tilpasse seg målantigener innen flere måneder. Suksessen til IVT mRNA-vaksiner mot COVID-19 i kliniske applikasjoner åpnet ikke bare en ny epoke med IVT mRNA-vaksineforskning og utvikling, men akkumulerte også verdifull erfaring for rask utvikling av effektive vaksiner for å håndtere utbrudd av smittsomme sykdommer10,11.
Til tross for det lovende potensialet til IVT mRNA-vaksiner, fortsetter effektiv intracellulær levering av IVT mRNA til virkningsstedet (dvs. cytoplasma) å utgjøre et stort hinder12, spesielt for de som administreres via luftveiene4. IVT mRNA er iboende et ustabilt molekyl med en ekstremt kort halveringstid (~ 7 t) 13, noe som gjør IVT mRNA svært utsatt for nedbrytning av den allestedsnærværende RNase14. Lymfocyttene i det medfødte immunsystemet har en tendens til å oppsluke det anerkjente IVT mRNA i tilfeller av in vivo-applikasjon . Videre svekker den høye negative ladningstettheten og den store molekylvekten (1 x 104-1 x 106 Da) av IVT mRNA dens effektive gjennomtrenging over det anioniske lipid-dobbeltlaget av cellulære membraner15. Derfor er det nødvendig med et leveringssystem med visse biofunksjonelle materialer for å hemme nedbrytningen av IVT mRNA-molekylene og lette cellulært opptak16.
Bortsett fra noen få unntakstilfeller der naken IVT mRNA ble direkte brukt til in vivo-undersøkelser, brukes forskjellige leveringssystemer for å bære IVT mRNA til det terapeutiske virkningsstedet17,18. Tidligere studier har vist at bare noen få IVT mRNA påvises i cytosol uten hjelp av et leveringssystem19. Det er utviklet mange strategier for å forbedre RNA-leveransen med kontinuerlig innsats i feltet, alt fra protaminkondensasjon til lipidinnkapsling20. Lipid nanopartikler (LNPs) er de mest klinisk avanserte blant mRNA-leveringskjøretøyene, som bevist av det faktum at alle godkjente mRNA COVID-19-vaksiner for klinisk bruk bruker LNP-baserte leveringssystemer21. LNPs kan imidlertid ikke formidle effektiv mRNA-transfeksjon når formuleringene leveres via respiratorisk rute22, noe som bemerkelsesverdig begrenser anvendelsen av disse formuleringene ved å indusere slimhinneimmunresponser eller adressere lungerelaterte sykdommer som cystisk fibrose eller α1-antitrypsinmangel. Derfor er det nødvendig å utvikle et nytt leveringssystem for å lette effektiv levering og transfeksjon av IVT mRNA i luftveisrelaterte celler for å løse dette udekkede behovet.
Det er bekreftet at peptid-poloxamin selvmontert nanopartikkel (PP-sNp) leveringssystem kan formidle effektiv transfeksjon av nukleinsyrer i luftveiene hos mus23. PP-sNp vedtar en multifunksjonell modulær designtilnærming, som kan integrere forskjellige funksjonelle moduler i nanopartikler for rask screening og optimalisering23. De syntetiske peptidene og elektrisk nøytrale amfifile blokk-kopolymerer (poloksamin) i PP-sNp kan spontant interagere med IVT mRNA for å generere jevnt fordelte nanopartikler med en kompakt struktur og glatt overflate23. PP-sNp kan forbedre gentransfeksjonseffekten av IVT mRNA-molekyler i dyrkede celler og luftveiene hos mus23. Denne studien beskriver en protokoll for generering av PP-sNp med IVT mRNA som koder for Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrollert og rask blanding via en mikrofluidisk blandingsanordning, som benytter forskjøvet fiskebensblandingsdesign, benyttes i denne protokollen. Prosedyren er enkel å utføre og tillater generering av PP-sNp med mer ensartede størrelser. Det generelle målet med PP-sNp-produksjon ved hjelp av den mikrofluidiske blanderen er å lage PP-sNp for mRNA-kompleksdannelse på en godt kontrollert måte, og dermed muliggjøre effektiv og reproduserbar celletransfeksjon in vitro. Denne protokollen beskriver forberedelse, montering og karakterisering av PP-sNp som inneholder MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her tillater ikke bare kostnadseffektiv og rask produksjon av IVT mRNA-vaksineformuleringer med definerte egenskaper, men det gir også muligheten til å tilpasse PP-sNP-formuleringen i henhold til spesifikke terapeutiske formål, for eksempel genterapi. For å sikre en vellykket generering av IVT mRNA/PP-sNp, foreslås det å være ekstra oppmerksom på noen kritiske trinn. Når du arbeider med mRNA, husk alltid at RNase-frie forhold bør opprettholdes gjennom hele prosessen fordi IVT mRNA er svær…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 og 82173764), hovedprosjektet i Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) av departementet for vitenskap og teknologi i Kina, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027), og Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Forfatterne er takknemlige for Dr. Xiaoyan Ding for å måle hydrodynamisk diameter (nm) og polydispersitetsindeks (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
