Effektiv transfektion av in vitro-transkriberat mRNA i odlade celler med användning av peptid-poloxaminnanopartiklar
Summary
En självmonterad peptid-poloxaminnanopartikel (PP-sNp) utvecklas med hjälp av en mikrofluidisk blandningsanordning för att kapsla in och leverera in vitro transkriberat budbärar-RNA. Det beskrivna mRNA / PP-sNp kan effektivt transfektera odlade celler in vitro.
Abstract
In vitro-transkriberade budbärar-RNA -vacciner (mRNA) har visat enorm potential i kampen mot coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi. Effektiva och säkra leveranssystem måste inkluderas i mRNA -vaccinerna på grund av mRNA -egenskaperna. Ett självmonterat peptid-poloxaminnanopartikel (PP-sNp) genleveranssystem är speciellt utformat för lungleverans av nukleinsyror och visar lovande förmåga att förmedla framgångsrik mRNA-transfektion. Här beskrivs en förbättrad metod för att förbereda PP-sNp för att utveckla hur PP-sNp kapslar in Metridia luciferase (MetLuc) mRNA och framgångsrikt transfekter odlade celler. MetLuc-mRNA erhålls genom en in vitro-transkriptionsprocess från en linjär DNA-mall. En PP-sNp framställs genom att blanda syntetisk peptid/poloxamin med mRNA-lösning med användning av en mikrofluidisk mixer, vilket möjliggör självmontering av PP-sNp. Laddningen av PP-sNp utvärderas därefter genom att mäta zetapotentialen. Under tiden mäts polydispersiteten och den hydrodynamiska storleken på PP-sNp-nanopartiklar med hjälp av dynamisk ljusspridning. mRNA / PP-sNp-nanopartiklarna transfekteras till odlade celler, och supernatanter från cellkulturen analyseras för luciferasaktivitet. De representativa resultaten visar deras förmåga till in vitro-transfektion. Detta protokoll kan belysa utvecklingen av nästa generations mRNA-vaccinleveranssystem.
Introduction
Vaccination har förkunnats som en av de mest effektiva medicinska insatserna för att minska sjukligheten och dödligheten orsakad av infektionssjukdomar1. Vikten av vacciner har visats sedan utbrottet av coronavirussjukdom 2019 (COVID-19). I motsats till det traditionella konceptet att injicera inaktiverade eller levande försvagade patogener koncentreras toppmoderna vaccinmetoder, såsom nukleinsyrabaserade vacciner, på att bevara de immunstimulerande egenskaperna hos målpatogenerna samtidigt som man undviker de potentiella säkerhetsproblemen i samband med de konventionella helmikrobiella virus- eller bakteriebaserade vaccinerna. Både DNA- och RNA -baserade (dvs. in vitro transkriberat budbärar-RNA, IVT mRNA) -baserade vacciner uppvisar profylaktisk till terapeutisk potential mot en mängd olika sjukdomar, inklusive infektionssjukdomar och cancer 2,3. I princip är potentialen hos nukleinsyrabaserade vacciner relaterad till deras produktion, effekt och säkerhet4. Dessa vacciner kan tillverkas på ett cellfritt sätt för att möjliggöra kostnadseffektiv, skalbar och snabb produktion.
Ett enda nukleinsyrabaserat vaccin kan koda för flera antigener, vilket möjliggör målet för många virusvarianter eller bakterier med ett minskat antal inokuleringar och stärker immunsvaret mot fjädrande patogener 5,6. Dessutom kan nukleinsyrabaserade vacciner efterlikna den naturliga invasionsprocessen av virus- eller bakterieinfektion, vilket ger både B-cell- och T-cellmedierade immunsvar. Till skillnad från vissa virus- eller DNA-baserade vacciner erbjuder IVT mRNA-baserade vacciner en enorm fördel när det gäller säkerhet. De kan snabbt uttrycka det önskade antigenet i cytosolen och är inte integrerade i värdgenomet, vilket undanröjer oro för insertional mutagenes7. IVT-mRNA bryts ned automatiskt efter framgångsrik översättning, så dess proteinuttryckskinetik kan enkelt kontrolleras 8,9. Katalyserad av den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi har ansträngningar från företag / institutioner över hela världen möjliggjort frisläppandet på marknaden av många typer av vacciner. IVT mRNA-baserad vaccinteknik visar stor potential och har för första gången visat sin tidigare förväntade framgång tack vare sin snabba design och flexibla förmåga att anpassa sig till alla målantigener inom flera månader. Framgången för IVT mRNA-vacciner mot COVID-19 i kliniska tillämpningar öppnade inte bara en ny era av forskning och utveckling av IVT mRNA-vaccin utan samlade också värdefull erfarenhet för snabb utveckling av effektiva vacciner för att hantera utbrott av infektionssjukdomar10,11.
Trots den lovande potentialen hos IVT mRNA -vacciner fortsätter den effektiva intracellulära leveransen av IVT mRNA till verkningsstället (dvs. cytoplasma) att utgöra ett stort hinder12, särskilt för dem som administreras via luftvägarna4. IVT mRNA är i sig en instabil molekyl med en extremt kort halveringstid (~ 7 h)13, vilket gör IVT mRNA mycket benäget för nedbrytning av det allestädes närvarande RNase14. Lymfocyterna i det medfödda immunsystemet tenderar att uppsluka det erkända IVT-mRNA vid applicering in vivo . Dessutom försämrar den höga negativa laddningstätheten och den stora molekylvikten (1 x 104-1 x 106 Da) av IVT mRNA dess effektiva genomträngning över det anjoniska lipid-dubbelskiktet av cellmembran15. Därför krävs ett leveranssystem med vissa biofunktionella material för att hämma nedbrytningen av IVT-mRNA-molekylerna och underlätta cellulärt upptag16.
Bortsett från några exceptionella fall där naken IVT-mRNA användes direkt för in vivo-undersökningar, används olika leveranssystem för att transportera IVT-mRNA till det terapeutiska verkningsstället17,18. Tidigare studier har visat att endast ett fåtal IVT-mRNA detekteras i cytosol utan hjälp av ett leveranssystem19. Många strategier har utvecklats för att förbättra RNA-leveransen med kontinuerliga ansträngningar inom området, allt från protaminkondensation till lipidinkapsling20. Lipidnanopartiklar (LNP) är de mest kliniskt avancerade bland mRNA-leveransfordonen, vilket bevisas av det faktum att alla godkända mRNA COVID-19-vacciner för klinisk användning använder LNP-baserade leveranssystem21. LNP kan emellertid inte förmedla effektiv mRNA-transfektion när formuleringarna levereras via andningsvägen22, vilket anmärkningsvärt begränsar tillämpningen av dessa formuleringar för att inducera slemhinneimmunsvar eller adressera lungrelaterade sjukdomar såsom cystisk fibros eller α1-antitrypsinbrist. Därför krävs det att utveckla ett nytt leveranssystem för att underlätta effektiv leverans och transfektion av IVT mRNA i luftvägsrelaterade celler för att lösa detta ouppfyllda behov.
Det har bekräftats att peptid-poloxamin självmonterad nanopartikel (PP-sNp) leveranssystem kan förmedla effektiv transfektion av nukleinsyror i luftvägarna hos möss23. PP-sNp antar en multifunktionell modulär designmetod, som kan integrera olika funktionella moduler i nanopartiklarna för snabb screening och optimering23. De syntetiska peptiderna och elektriskt neutrala amfifila blocksampolymererna (poloxamin) inom PP-sNp kan spontant interagera med IVT mRNA för att generera jämnt fördelade nanopartiklar med en kompakt struktur och slät yta23. PP-sNp kan förbättra gentransfektionseffekten av IVT mRNA-molekyler i odlade celler och luftvägarna hos möss23. Denna studie beskriver ett protokoll för att generera PP-sNp innehållande IVT mRNA som kodar metridia luciferas (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrollerad och snabb blandning via en mikrofluidisk blandningsanordning, som använder den förskjutna sillbensblandningsdesignen, används i detta protokoll. Proceduren är enkel att utföra och möjliggör generering av PP-sNp med mer enhetliga storlekar. Det allmänna målet med PP-sNp-produktion med hjälp av mikrofluidikblandaren är att skapa PP-sNp för mRNA-komplexbildning på ett välkontrollerat sätt, vilket möjliggör effektiv och reproducerbar celltransfektion in vitro. Detta protokoll beskriver beredning, montering och karakterisering av PP-sNp innehållande MetLuc-mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillåter inte bara kostnadseffektiv och snabb produktion av IVT mRNA-vaccinformuleringar med definierade egenskaper, men det erbjuder också möjligheten att anpassa PP-sNp-formuleringen enligt specifika terapeutiska ändamål, såsom genterapi. För att säkerställa en framgångsrik generering av IVT mRNA / PP-sNp föreslås att man ägnar extra uppmärksamhet åt några kritiska steg. När du arbetar med mRNA, kom alltid ihåg att RNas-fria förhållanden bör bibehållas under hela proc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 och 82173764), det stora projektet Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) av Kinas ministerium för vetenskap och teknik, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) och Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Författarna är tacksamma mot Dr. Xiaoyan Ding för att ha mätt den hydrodynamiska diametern (nm) och polydispersitetsindexet (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
