Transfection efficace d’ARNm transcrit in vitro dans des cellules cultivées à l’aide de nanoparticules de peptide-poloxamine
Summary
Une nanoparticule peptide-poloxamine auto-assemblée (PP-sNp) est développée à l’aide d’un dispositif de mélange microfluidique pour encapsuler et délivrer in vitro de l’ARN messager transcrit. L’ARNm/PP-sNp décrit pourrait transfecter efficacement des cellules cultivées in vitro.
Abstract
Les vaccins à ARN messager transcrit in vitro (ARNm) ont montré un énorme potentiel dans la lutte contre la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Des systèmes d’administration efficaces et sûrs doivent être inclus dans les vaccins à ARNm en raison des propriétés fragiles de l’ARNm. Un système de livraison de gènes de nanoparticules peptide-poloxamine (PP-sNp) auto-assemblé est spécialement conçu pour l’administration pulmonaire d’acides nucléiques et présente des capacités prometteuses dans la médiation d’une transfection réussie de l’ARNm. Ici, une méthode améliorée de préparation de PP-sNp est décrite pour expliquer comment le PP-sNp encapsule l’ARNm de la Metridia luciferase (MetLuc) et transfecte avec succès les cellules en culture. L’ARNm MetLuc-est obtenu par un processus de transcription in vitro à partir d’un modèle d’ADN linéaire. Un PP-sNp est produit en mélangeant un peptide synthétique / poloxamine avec une solution d’ARNm à l’aide d’un mélangeur microfluidique, permettant l’auto-assemblage de PP-sNp. La charge de PP-sNp est ensuite évaluée en mesurant le potentiel zêta. Pendant ce temps, la polydispersité et la taille hydrodynamique des nanoparticules PP-sNp sont mesurées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière. Les nanoparticules d’ARNm / PP-sNp sont transfectées dans des cellules en culture, et les surnageants de la culture cellulaire sont dosés pour l’activité de la luciférase. Les résultats représentatifs démontrent leur capacité de transfection in vitro. Ce protocole pourrait faire la lumière sur le développement de systèmes d’administration de vaccins à ARNm de nouvelle génération.
Introduction
La vaccination a été annoncée comme l’une des interventions médicales les plus efficaces pour réduire la morbidité et la mortalité causées par les maladies infectieuses1. L’importance des vaccins a été démontrée depuis l’épidémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Contrairement au concept traditionnel d’injection d’agents pathogènes inactivés ou vivants atténués, les approches vaccinales de pointe, telles que les vaccins à base d’acides nucléiques, se concentrent sur la préservation des propriétés immunostimulantes des agents pathogènes cibles tout en évitant les problèmes d’innocuité potentiels associés aux vaccins conventionnels à base de virus microbiens entiers ou à bactéries. Les vaccins à base d’ADN et d’ARN (c.-à-d. ARN messager transcrit in vitro, ARNm IVT) présentent un potentiel prophylactique à thérapeutique contre diverses maladies, y compris les maladies infectieuses et les cancers 2,3. En principe, le potentiel des vaccins à base d’acides nucléiques est lié à leur production, à leur efficacité et à leur innocuité4. Ces vaccins peuvent être fabriqués sans cellules pour permettre une production rentable, évolutive et rapide.
Un seul vaccin à base d’acide nucléique peut coder pour plusieurs antigènes, ce qui permet de cibler de nombreuses variantes virales ou bactéries avec un nombre réduit d’inoculations et de renforcer la réponse immunitaire contre les agents pathogènes résilients 5,6. En outre, les vaccins à base d’acides nucléiques pourraient imiter le processus d’invasion naturel d’une infection virale ou bactérienne, apportant à la fois des réponses immunitaires médiées par les cellules B et T. Contrairement à certains vaccins à base de virus ou d’ADN, les vaccins à base d’ARNm IVT offrent un énorme avantage en termes de sécurité. Ils peuvent rapidement exprimer l’antigène désiré dans le cytosol et ne sont pas intégrés dans le génome de l’hôte, ce qui évite les inquiétudes concernant la mutagénèse insertionnelle7. L’ARNm IVT est automatiquement dégradé après une traduction réussie, de sorte que sa cinétique d’expression protéique peut être facilement contrôlée 8,9. Catalysés par la pandémie de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), les efforts des entreprises / institutions du monde entier ont permis la mise sur le marché de nombreux types de vaccins. La technologie vaccinale à base d’ARNm IVT présente un grand potentiel et, pour la première fois, a démontré son succès précédemment attendu, en raison de sa conception rapide et de sa capacité flexible à s’adapter à n’importe quel antigène cible en quelques mois. Le succès des vaccins à ARNm IVT contre la COVID-19 dans les applications cliniques a non seulement ouvert une nouvelle ère de recherche et de développement de vaccins à ARNm IVT, mais a également accumulé une expérience précieuse pour le développement rapide de vaccins efficaces pour faire face aux épidémies de maladies infectieuses10,11.
Malgré le potentiel prometteur des vaccins à ARNm IVT, l’administration intracellulaire efficace de l’ARNm IVT au site d’action (cytoplasme) continue de poser un obstacle majeur12, en particulier pour ceux administrés par les voies respiratoires4. L’ARNm IVT est intrinsèquement une molécule instable avec une demi-vie extrêmement courte (~7 h)13, ce qui rend l’ARNm IVT très sujet à la dégradation par l’omniprésente RNase14. Les lymphocytes du système immunitaire inné ont tendance à engloutir l’ARNm IVT reconnu en cas d’application in vivo . De plus, la densité de charge négative élevée et le poids moléculaire élevé (1 x 104-1 x 106 Da) de l’ARNm IVT altèrent sa perméation efficace à travers la bicouche lipidique anionique des membranes cellulaires15. Par conséquent, un système d’administration avec certains matériaux biofonctionnels est nécessaire pour inhiber la dégradation des molécules d’ARNm IVT et faciliter l’absorption cellulaire16.
Mis à part quelques cas exceptionnels dans lesquels l’ARNm IVT nu a été directement utilisé pour des investigations in vivo, divers systèmes d’administration sont utilisés pour transporter l’ARNm IVT vers le site d’action thérapeutique17,18. Des études antérieures ont révélé que seuls quelques ARNm IVT sont détectés dans le cytosol sans l’aide d’un système d’administration19. De nombreuses stratégies ont été développées pour améliorer la livraison de l’ARN avec des efforts continus sur le terrain, allant de la condensation de protamine à l’encapsulationlipidique 20. Les nanoparticules lipidiques (LNP) sont les plus avancées cliniquement parmi les véhicules d’administration d’ARNm, comme le prouve le fait que tous les vaccins à ARNm COVID-19 approuvés pour un usage clinique utilisent des systèmes d’administration basés sur la LNP21. Cependant, les LNP ne peuvent pas arbitrer une transfection efficace de l’ARNm lorsque les formulations sont administrées par voie respiratoire22, ce qui limite remarquablement l’application de ces formulations pour induire des réponses immunitaires muqueuses ou traiter des maladies pulmonaires telles que la mucoviscidose ou le déficit en α1-antitrypsine. Par conséquent, le développement d’un nouveau système d’administration pour faciliter la livraison et la transfection efficaces de l’ARNm IVT dans les cellules liées aux voies respiratoires est nécessaire pour répondre à ce besoin non satisfait.
Il a été confirmé que le système d’administration de nanoparticules auto-assemblées peptide-poloxamine (PP-sNp) peut arbitrer la transfection efficace des acides nucléiques dans les voies respiratoires des souris23. Le PP-sNp adopte une approche de conception modulaire multifonctionnelle, qui peut intégrer différents modules fonctionnels dans les nanoparticules pour un criblage et une optimisation rapides23. Les peptides synthétiques et les copolymères blocs amphiphiles électriquement neutres (poloxamine) au sein du PP-sNp peuvent interagir spontanément avec l’ARNm IVT pour générer des nanoparticules uniformément distribuées avec une structure compacte et une surface lisse23. PP-sNp peut améliorer l’effet de transfection génique des molécules d’ARNm IVT dans les cellules en culture et les voies respiratoires de souris23. La présente étude décrit un protocole de génération d’ARNm PP-sNp contenant de l’IVT codant pour la Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figure 1). Un mélange contrôlé et rapide via un dispositif de mélange microfluidique, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalés, est utilisé dans ce protocole. La procédure est facile à exécuter et permet la génération de PP-sNp avec des tailles plus uniformes. L’objectif général de la production de PP-sNp à l’aide du mélangeur microfluidique est de créer du PP-sNp pour la complexation de l’ARNm de manière bien contrôlée, permettant ainsi une transfection cellulaire efficace et reproductible in vitro. Le présent protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation du PP-sNp contenant de l’ARNm MetLuc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici permet non seulement la production rentable et rapide de formulations de vaccins à ARNm IVT avec des propriétés définies, mais il offre également la possibilité de personnaliser la formulation PP-sNp en fonction d’objectifs thérapeutiques spécifiques, tels que la thérapie génique. Afin d’assurer la génération réussie de l’ARNm IVT / PP-sNp, il est suggéré de porter une attention particulière à certaines étapes critiques. Lorsque vous travaillez avec l’ARNm, rappelez-vous…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, subvention n ° 82041045 et 82173764), le projet majeur de l’étude sur la pathogenèse et le système technologique de prévention des épidémies (2021YFC2302500) par le ministère des Sciences et de la Technologie de Chine, le projet Chongqing Talents: Exceptional Young Talents (CQYC202005027) et la Fondation des sciences naturelles de Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Les auteurs remercient le Dr Xiaoyan Ding d’avoir mesuré le diamètre hydrodynamique (nm) et l’indice de polydispersité (PDI).
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
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