في المختبر تقييم النشاط الخلوي لمساعد لقاح المستحلب النانوي Ophiopogonin D
Summary
يقدم البروتوكول طرقا مفصلة لتقييم ما إذا كان المستحلب النانوي ophiopogonin D المساعد يعزز الاستجابات المناعية الخلوية الفعالة.
Abstract
كمكون رئيسي للقاحات ، يمكن للمواد المساعدة أن تحفز أو تعزز بشكل مباشر الاستجابات المناعية القوية والواسعة الانتشار والفطرية والتكيفية المرتبطة بالمستضدات. تم العثور على Ophiopogonin D (OP-D) ، وهو مكون منقى مستخرج من نبات Ophiopogon japonicus ، ليكون مفيدا كمساعد للقاح. يمكن التغلب على مشاكل الذوبان المنخفض والسمية ل OP-D بشكل فعال باستخدام طريقة استحلاب منخفضة الطاقة لإعداد المستحلب النانوي ophiopogonin D (NOD). في هذه المقالة ، يتم فحص سلسلة من البروتوكولات في المختبر لتقييم النشاط الخلوي. تم تحديد التأثيرات السامة للخلايا ل L929 باستخدام مقايسة مجموعة عد الخلايا -8. بعد ذلك ، تم الكشف عن مستويات السيتوكين المفرزة وأرقام الخلايا المناعية المقابلة بعد تحفيز وثقافة الخلايا الطحالية من الفئران المحصنة بواسطة طرق ELISA و ELISpot. بالإضافة إلى ذلك ، تمت ملاحظة قدرة امتصاص المستضد في الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم (BMDCs) ، والتي تم عزلها من الفئران C57BL / 6 ونضجت بعد الحضانة باستخدام GM-CSF بالإضافة إلى IL-4 ، بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر (CLSM). الأهم من ذلك ، تم تأكيد تنشيط البلاعم من خلال قياس مستويات السيتوكينات IL-1β و IL-6 وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) بواسطة مجموعات ELISA بعد استزراع البلاعم البريتونية (PMs) من الفئران الفارغة مع المساعد لمدة 24 ساعة. ومن المأمول أن يزود هذا البروتوكول الباحثين الآخرين بمناهج تجريبية مباشرة وفعالة لتقييم كفاءة الاستجابة الخلوية للمواد المساعدة الجديدة للقاحات.
Introduction
اللقاحات وسيلة مهمة للوقاية من الأمراض المعدية وغير السارية وعلاجها. تعد الإضافة المناسبة للمواد المساعدة ووسائل التوصيل إلى تركيبات اللقاح مفيدة لتعزيز مناعة المستضدات وتوليد استجابات مناعية طويلة الأمد1. بالإضافة إلى الشب المساعد الكلاسيكي (ملح الألومنيوم) ، هناك ستة أنواع من المواد المساعدة للقاحات التي يتم تسويقها حاليا: MF59 2,3 و AS04 3 و AS03 3 و AS01 3 و CpG1018 4 و Matrix-M5. بشكل عام ، عندما يواجه جسم الإنسان هجوما فيروسيا ، فإن خطي الدفاع الأول والثاني (الجلد والغشاء المخاطي والبلاعم) يأخذان زمام المبادرة في إزالة الفيروس ، وأخيرا ، يتم تنشيط خط الدفاع الثالث ، الذي يشمل الأعضاء المناعية والخلايا المناعية. كانت أملاح الألومنيوم والألمنيوم أكثر المواد المساعدة استخداما على نطاق واسع للقاحات البشرية منذ أوائل 1920s ، مما أثار استجابة مناعية فطرية فعالة6. ومع ذلك ، فقد اقترح أن تنشيط الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) بواسطة المواد المساعدة الكلاسيكية ، والتي تحفز الخلايا المناعية على توليد مجموعات محددة من السيتوكينات والكيموكينات ، هي الآلية التي تعمل بها المواد المساعدة وقد تكون أحد الأسباب التي تجعل المواد المساعدة تمارس تأثيرات عابرة فقط على استجابات مناعية محددة7. يعد وجود مواد مساعدة مرخصة محدودة للاستخدام البشري عاملا مقيدا لتطوير اللقاحات التي تثير استجابات مناعية فعالة8.
حاليا ، يظهر عدد متزايد من الدراسات المساعدة القدرة على إحداث استجابة مناعية خلوية قوية في الفئران. لقد ثبت أن QS-21 يحفز استجابة مناعية متوازنة T-helper 1 (Th1) و T-helper 2 (Th2) ، وينتج مستويات أعلى من عيار الأجسام المضادة ، ويطيل الحماية كمساعد ، لكن سميته القوية وخصائصه الانحلالية تحد من تطوره كمساعد سريري مستقل 9,10. OP-D (روسجوجينين-O-α-L-rhamnopyranosy1- (1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) هو أحد الصابونين الستيرويدية المعزولة من جذر النبات الطبي الصيني Ophiopogon japonicas4. بالإضافة إلى ذلك ، فهو المكون الرئيسي النشط دوائيا (شين ماي سان) الموجود في Radix Ophiopogonis ومن المعروف أن له خصائص دوائية معينة11. علاوة على ذلك ، فهو عضو في عائلة Liliaceae ويستخدم على نطاق واسع لآثاره المثبطة والوقائية في التهاب الخلايا وإصابة عضلة القلب. على سبيل المثال ، يحسن OP-D الآفات الشبيهة بالتهاب الجلد التأتبي الناجم عن DNCB وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) خلايا HaCaT الالتهابية في الفئران BALB / c12. الأهم من ذلك ، يعزز OP-D الحماية المضادة للأكسدة لنظام القلب والأوعية الدموية ويحمي القلب من إصابة الالتهام الذاتي التي يسببها دوكسوروبيسين عن طريق تقليل كل من توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتعطيل تلف غشاء الميتوكوندريا. أظهرت التجارب أن تناول OP-D مع أحادي ديسموسيد يساعد على تعزيز صحة المناعة ، وزيادة عدد خلايا الدم البيضاء وتخليق الحمض النووي ، وجعل الأجسام المضادة تدوم لفترة أطول13. وقد وجد سابقا أن OP-D له تأثير مساعد14.
المستحلبات النانوية عبارة عن تركيبات نانوية من الزيت في الماء تتكون من مزيج من المواد الخافضة للتوتر السطحي والزيت والمواد الخافضة للتوتر السطحي والماء12,15. تسمح تصميمات اللقاحات النانوية هذه بتغليف المستضدات والمواد المساعدة معا لتعزيز التحفيز المناعي وحماية المستضدات وتعزيز نضوج الخلايا المتغصنة (DC)16. لتطوير هذه المواد المساعدة الجديدة التي تم الحصول عليها من الفحص ، من المهم إيجاد طرق مناسبة لتقييم قدرات الاستجابة الخلوية الخاصة بهم.
الغرض من هذا البروتوكول هو التقييم المنهجي لما إذا كانت المواد المساعدة يمكن أن تعزز البلعمة والتعبير عن الخلايا المناعية في زراعة الخلايا في المختبر وتوضيح الطرق التجريبية الرئيسية. تنقسم التجربة إلى أربعة أقسام فرعية: (1) يتم تحديد سمية OP-D و NOD لخلايا L929 بواسطة فحص مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) ؛ (2) يتم الكشف عن مستويات السيتوكين في الغدد الصماء IFN-γ و IL-17A وأرقام الخلايا المقابلة في الفئران المحصنة عن طريق تحفيز الخلايا الطحالية ومقايسات ELISpot ؛ (3) لوحظت قدرة عرض المستضد ل DCs بعد التحفيز المساعد باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر ؛ و (4) تم الكشف عن الأنواع الثلاثة من السيتوكينات ، IL-1β و IL-6 و TNF-α ، في المواد الطافية التي تم الحصول عليها من الضامة البريتونية (PMs) في الفئران الطبيعية المستزرعة مع المواد المساعدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر لقاحات الوحدات الفرعية أمانا ممتازا ولكنها ضعيفة المناعة. تتمثل الاستراتيجية الرئيسية لتعزيز الاستمناع في الامتزاز المادي أو إقران المستضدات بالمواد المساعدة ودمجها في أنظمة توصيل الأدوية لتعزيز امتصاص وعرض المستضدات النامية. الصابونين النباتي الطبيعي مثل quillaia saponin ومشتقاته شديد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بالمنحة رقم 2021YFC2302603 من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين ، والمنح رقم 31670938 ، و 32070924 ، و 82041045 ، و 32000651 من برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، والمنح رقم 2014jcyjA0107 ورقم 2019jcyjA-msxmx0159 من برنامج مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ ، المنحة رقم. CYS21519 من مشروع أبحاث الدراسات العليا والابتكار في تشونغتشينغ ، المنحة رقم 2020XBK24 من المشاريع الخاصة بجامعة الجيش الطبية ، والمنحة رقم 202090031021 من البرنامج الوطني للابتكار وريادة الأعمال لطلاب الجامعات.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
