In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D
Summary
Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l’adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.
Abstract
Come ingrediente principale dei vaccini, gli adiuvanti possono indurre o migliorare direttamente le risposte immunitarie potenti, diffuse, innate e adattative associate agli antigeni. Ophiopogonin D (OP-D), un componente purificato estratto dalla pianta Ophiopogon japonicus, è stato trovato utile come adiuvante del vaccino. I problemi della bassa solubilità e tossicità dell’OP-D possono essere efficacemente superati utilizzando un metodo di emulsificazione a bassa energia per preparare la nanoemulsione ofiopogonina D (NOD). In questo articolo vengono esaminati una serie di protocolli in vitro per la valutazione dell’attività cellulare. Gli effetti citotossici di L929 sono stati determinati utilizzando un test kit-8 per il conteggio delle cellule. Quindi, i livelli di citochine secreti e il corrispondente numero di cellule immunitarie dopo la stimolazione e la coltura di splenociti da topi immunizzati sono stati rilevati con metodi ELISA ed ELISpot. Inoltre, la capacità di assorbimento dell’antigene nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC), che sono state isolate da topi C57BL / 6 e maturate dopo l’incubazione con GM-CSF più IL-4, è stata osservata mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM). È importante sottolineare che l’attivazione dei macrofagi è stata confermata misurando i livelli di IL-1β, IL-6 e citochine del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) mediante kit ELISA dopo aver cocoltivato macrofagi peritoneali (PM) da topi bianchi con l’adiuvante per 24 ore. Si spera che questo protocollo fornirà ad altri ricercatori approcci sperimentali diretti ed efficaci per valutare l’efficacia della risposta cellulare di nuovi adiuvanti vaccinali.
Introduction
I vaccini sono un mezzo importante per prevenire e curare le malattie infettive e non trasmissibili. L’aggiunta appropriata di adiuvanti e veicoli di somministrazione alle formulazioni dei vaccini è utile per migliorare l’immunogenicità degli antigeni e generare risposte immunitarie durature1. Oltre al classico allume adiuvante (sale di alluminio), ci sono sei tipi di adiuvanti per i vaccini che sono attualmente commercializzati: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Generalmente, quando il corpo umano incontra un attacco virale, la prima e la seconda linea di difesa (pelle, mucosa e macrofagi) prendono il comando nell’eliminazione del virus e, infine, viene attivata la terza linea di difesa, che coinvolge gli organi immunitari e le cellule immunitarie. L’alluminio e i sali di alluminio sono stati gli adiuvanti più utilizzati per i vaccini umani sin dai primi anni 1920, suscitando un’efficace risposta immunitaria innata6. Tuttavia, è stato proposto che l’attivazione delle cellule presentanti l’antigene (APC) da parte degli adiuvanti classici, che stimola le cellule immunitarie a generare serie specifiche di citochine e chemochine, è il meccanismo attraverso il quale funzionano gli adiuvanti e può essere uno dei motivi per cui gli adiuvanti esercitano solo effetti transitori su specifiche risposte immunitarie7. La presenza di adiuvanti autorizzati limitati per uso umano è un fattore restrittivo per lo sviluppo di vaccini che suscitano risposte immunitarie efficaci8.
Attualmente, un numero crescente di studi adiuvanti sta dimostrando la capacità di indurre una forte risposta immunitaria cellulare nei topi. QS-21 ha dimostrato di indurre una risposta immunitaria bilanciata T-helper 1 (Th1) e T-helper 2 (Th2), produrre livelli più elevati di titoli anticorpali e prolungare la protezione come adiuvante, ma la sua forte tossicità e le proprietà emolitiche limitano il suo sviluppo come adiuvante clinico autonomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopyranoside) è una delle saponine steroidee isolate dalla radice della pianta medicinale cinese Ophiopogon japonicas4. Inoltre, è il principale componente farmacologicamente attivo (Shen Mai San) trovato in Radix Ophiopogonis ed è noto per avere alcune proprietà farmacologiche11. Inoltre, è un membro della famiglia delle Liliaceae ed è ampiamente utilizzato per i suoi effetti inibitori e protettivi nell’infiammazione cellulare e nel danno miocardico. Ad esempio, OP-D migliora le lesioni simili alla dermatite atopica indotte da DNCB e le cellule HaCaT infiammatorie del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nei topi BALB / c12. È importante sottolineare che OP-D promuove la protezione antiossidante del sistema cardiovascolare e protegge il cuore dal danno autofagico indotto dalla doxorubicina riducendo sia la generazione di specie reattive dell’ossigeno che interrompendo il danno alla membrana mitocondriale. Gli esperimenti hanno dimostrato che l’assunzione di OP-D con mono-desmoside aiuta a migliorare la salute immunitaria, aumentare la conta dei globuli bianchi e la sintesi del DNA e far durare più a lungo gli anticorpi13. In precedenza è stato riscontrato che l’OP-D ha un effetto adiuvante14.
Le nanoemulsioni sono nanoformulazioni olio-in-acqua composte da una combinazione di tensioattivi, olio, tensioattivi e acqua12,15. Questi progetti di nanovaccini consentono di incapsulare insieme antigeni e adiuvanti per migliorare la stimolazione immunitaria, proteggere gli antigeni e promuovere la maturazione delle cellule dendritiche (DC)16. Per lo sviluppo di questi nuovi adiuvanti ottenuti dallo screening, è importante trovare metodi appropriati per valutare le loro capacità di risposta cellulare.
Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare sistematicamente se gli adiuvanti possono migliorare la fagocitosi e l’espressione di cellule immunitarie in colture cellulari in vitro e di elaborare i principali metodi sperimentali. L’esperimento è diviso in quattro sottosezioni: (1) la tossicità di OP-D e NOD per le cellule L929 è determinata dal test del kit-8 (CCK-8) per il conteggio delle cellule; (2) i livelli di citochine di IFN-γ endocrino e IL-17A e il numero di cellule corrispondenti nei topi immunizzati sono rilevati mediante stimolazione degli splenociti e saggi ELISpot; (3) la capacità di presentazione dell’antigene delle DC dopo stimolazione adiuvante è osservata utilizzando la microscopia confocale; e (4) vengono rilevati i tre tipi di citochine, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nei supernatanti ottenuti da macrofagi peritoneali (PM) in topi normali in cocoltura con adiuvanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
I vaccini a subunità forniscono un’eccellente sicurezza ma scarsa immunogenicità. La strategia principale per migliorare l’immunogenicità consiste nell’assorbire fisicamente o accoppiare gli antigeni con adiuvanti e incorporarli nei sistemi di somministrazione dei farmaci per promuovere l’assorbimento e la presentazione da parte delle DC. Le saponine vegetali naturali come la saponina di quillaia e i suoi derivati sono altamente tossiche e non sono adatte allo sviluppo di vaccini umani17. Perta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione n. 2021YFC2302603 del National Key Research and Development Program of China, sovvenzioni n. 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 del National Natural Science Foundation Program of China, sovvenzioni n. 2014jcyjA0107 e n. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing, sovvenzione n. CYS21519 del Progetto di ricerca e innovazione post-laurea di Chongqing, sovvenzione n. 2020XBK24 dei progetti speciali dell’Università medica dell’esercito e sovvenzione n. 202090031021 del Programma nazionale di innovazione e imprenditorialità per studenti universitari.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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