В пробирке Оценка клеточной активности наноэмульсионной вакцины Адъювант офиопогонин D
Summary
В протоколе представлены подробные методы оценки того, способствует ли наноэмульсионный адъювант офиопогонина D эффективным клеточным иммунным реакциям.
Abstract
В качестве основного ингредиента вакцин адъюванты могут непосредственно индуцировать или усиливать мощные, широко распространенные, врожденные и адаптивные иммунные реакции, связанные с антигенами. Было обнаружено, что офиопогонин D (OP-D), очищенный компонент, извлеченный из растения Ophiopogon japonicus, полезен в качестве адъюванта вакцины. Проблемы низкой растворимости и токсичности OP-D могут быть эффективно преодолены с помощью метода низкоэнергетического эмульгирования для получения наноэмульсии офиопогонина D (NOD). В этой статье рассматривается ряд протоколов in vitro для оценки клеточной активности. Цитотоксические эффекты L929 определяли с помощью анализа набора для подсчета клеток-8. Затем секретируемые уровни цитокинов и соответствующие номера иммунных клеток после стимуляции и культивирования спленоцитов у иммунизированных мышей были обнаружены методами ИФА и ELISpot. Кроме того, способность поглощения антигена в дендритных клетках костного мозга (BMDC), которые были выделены у мышей C57BL/6 и созрели после инкубации с GM-CSF плюс IL-4, наблюдалась с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (CLSM). Важно отметить, что активация макрофагов была подтверждена путем измерения уровней цитокинов IL-1β, IL-6 и альфа-фактора некроза опухоли (TNF-α) с помощью наборов ИФА после кокультурирования перитонеальных макрофагов (ПМ) у чистых мышей с адъювантом в течение 24 ч. Есть надежда, что этот протокол предоставит другим исследователям прямые и эффективные экспериментальные подходы к оценке эффективности клеточного ответа новых вакцинных адъювантов.
Introduction
Вакцины являются важным средством профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний. Соответствующее добавление адъювантов и средств доставки в составы вакцин полезно для повышения иммуногенности антигенов и генерации длительных иммунных реакций1. В дополнение к классическим адъювантным квасцам (алюминиевая соль), существует шесть видов адъювантов для вакцин, которые в настоящее время продаются: MF59 2,3, AS043,AS03 3, AS013, CpG10184 и Matrix-M5. Как правило, когда организм человека сталкивается с вирусной атакой, первая и вторая линии защиты (кожа, слизистая оболочка и макрофаги) берут на себя инициативу в очистке вируса, и, наконец, активируется третья линия защиты, включающая иммунные органы и иммунные клетки. Алюминий и соли алюминия были наиболее широко используемыми адъювантами для вакцин человека с начала 1920-х годов, вызывая эффективный врожденный иммунный ответ6. Однако было высказано предположение, что активация антигенпрезентирующих клеток (АПК) классическими адъювантами, которая стимулирует иммунные клетки генерировать специфические наборы цитокинов и хемокинов, является механизмом, с помощью которого работают адъюванты, и может быть одной из причин, по которой адъюванты оказывают только преходящее воздействие на специфические иммунные реакции7. Наличие ограниченных лицензированных адъювантов для использования человеком является ограничительным фактором для разработки вакцин, которые вызывают эффективные иммунные реакции8.
В настоящее время все большее число адъювантных исследований демонстрирует способность индуцировать сильный клеточный иммунный ответ у мышей. Было показано, что QS-21 индуцирует сбалансированный иммунный ответ Т-хелпер 1 (Th1) и Т-хелпер 2 (Th2), продуцирует более высокие уровни титров антител и продлевает защиту в качестве адъюванта, но его сильная токсичность и гемолитические свойства ограничивают его развитие в качестве автономного клинического адъюванта 9,10. OP-D (рускогенин-O-α-L-рамнопиранозии1-(1→2)-β-D-ксилопиранозил-(1→3)-β-D-фукопиранозид) является одним из стероидных сапонинов, выделенных из корня китайского лекарственного растения Ophiopogon japonicas4. Кроме того, это главный фармакологически активный компонент (Shen Mai San), обнаруженный в Radix Ophiopogonis и, как известно, обладающий определенными фармакологическими свойствами11. Кроме того, он является членом семейства Liliaceae и широко используется для его ингибирующих и защитных эффектов при клеточном воспалении и повреждении миокарда. Например, OP-D улучшает DNCB-индуцированные атопические дерматитоподобные поражения и альфа-фактор некроза опухоли (TNF-α) воспалительные клетки HaCaT у мышей BALB/c12. Важно отметить, что OP-D способствует антиоксидантной защите сердечно-сосудистой системы и защищает сердце от аутофагического повреждения, вызванного доксорубицином, уменьшая как генерацию активных форм кислорода, так и нарушая повреждение митохондриальной мембраны. Эксперименты показали, что прием OP-D с монодесмозидом помогает укрепить иммунное здоровье, увеличить количество лейкоцитов и синтез ДНК, а также продлить срок действия антител13. Ранее было установлено, что OP-D обладает адъювантным эффектом14.
Наноэмульсии представляют собой наноформуляции «масло в воде», состоящие из комбинации поверхностно-активных веществ, масла, соврафактантов и воды12,15. Эти нановакцинные конструкции позволяют инкапсулировать антигены и адъюванты вместе для усиления иммунной стимуляции, защиты антигенов и содействия созреванию дендритных клеток (DC)16. Для разработки этих новых адъювантов, полученных в результате скрининга, важно найти соответствующие методы оценки их способностей клеточного ответа.
Целью этого протокола является систематическая оценка того, могут ли адъюванты усиливать фагоцитоз и экспрессию иммунных клеток в культуре клеток in vitro , и разработка основных экспериментальных методов. Эксперимент разделен на четыре подраздела: (1) токсичность OP-D и NOD для клеток L929 определяется с помощью анализа набора для подсчета клеток-8 (CCK-8); (2) уровни цитокинов эндокринных IFN-γ и IL-17A и соответствующие номера клеток у иммунизированных мышей обнаруживаются с помощью стимуляции спленоцитов и анализов ELISpot; (3) антигенная презентационная способность ДК после адъювантной стимуляции наблюдается с помощью конфокальной микроскопии; и (4) обнаруживаются три вида цитокинов, IL-1β, IL-6 и TNF-α, в супернатантах, полученных из перитонеальных макрофагов (ПМ) у нормальных мышей, кокутивированных с адъювантами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Субъединичные вакцины обеспечивают отличную безопасность, но плохую иммуногенность. Основная стратегия повышения иммуногенности заключается в физическом адсорбировании или соединении антигенов с адъювантами и включении их в системы доставки лекарств для содействия поглощению и пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом No 2021YFC2302603 Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая, грантами No 31670938, 32070924, 82041045 и 32000651 Программы Национального фонда естественных наук Китая, грантами No 2014jcyjA0107 и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина, грантом No CYS21519 Проекта исследований и инноваций для аспирантов Чунцина, грант No 2020XBK24 Специальных проектов Армейского медицинского университета и грант No 202090031021 Национальной программы инноваций и предпринимательства для студентов колледжей.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
