במבחנה הערכת פעילות תאית של חיסון ננו-אמולסיה אדג'ובנט אופיופוגונין D
Summary
הפרוטוקול מציג שיטות מפורטות להערכה אם ננו-אמולסיה אופיופוגונין D אדג’ובנט מקדם תגובות חיסוניות תאיות יעילות.
Abstract
כמרכיב עיקרי בחיסונים, אדג’ובנטים יכולים לגרום או לשפר באופן ישיר את התגובות החיסוניות החזקות, הנפוצות, המולדות והנרכשות הקשורות לאנטיגנים. Epiopogonin D (OP-D), רכיב מטוהר המופק מהצמח Ophiopogon japonicus, נמצא שימושי כאדג’ובנט לחיסון. ניתן להתגבר ביעילות על הבעיות של המסיסות והרעילות הנמוכה של OP-D על ידי שימוש בשיטת תחליב באנרגיה נמוכה להכנת ננו-אמולסיה אופיופוגונין D (NOD). במאמר זה נבחנת סדרה של פרוטוקולים חוץ-גופיים להערכת פעילות תאית. ההשפעות הציטוטוקסיות של L929 נקבעו באמצעות בדיקת ערכת ספירת תאים-8. לאחר מכן, רמות הציטוקינים המופרשים ומספר תאי החיסון המתאימים לאחר הגירוי והתרבית של ספלנוציטים מעכברים מחוסנים זוהו בשיטות ELISA ו-ELISpot. בנוסף, יכולת ספיגת האנטיגן בתאים דנדריטיים שמקורם במח עצם (BMDCs), שבודדו מעכברי C57BL/6 והבשילו לאחר הדגירה עם GM-CSF בתוספת IL-4, נצפתה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר (CLSM). חשוב לציין שהפעלת המקרופאגים אושרה על ידי מדידת הרמות של ציטוקינים מסוג IL-1β, IL-6 וגורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) על ידי ערכות ELISA לאחר שקוקולט מקרופאגים פריטוניאליים (PMs) מעכברים ריקים עם האדג’ובנט במשך 24 שעות. התקווה היא שפרוטוקול זה יספק לחוקרים אחרים גישות ניסוייות ישירות ויעילות להערכת יעילות התגובה התאית של אדג’ובנטים חדשניים לחיסונים.
Introduction
חיסונים הם אמצעי חשוב למניעה וטיפול במחלות זיהומיות ולא קומוניקטיביות. התוספת המתאימה של אדג’ובנטים וכלי משלוח לפורמולציות חיסונים מועילה להגברת האימונוגניות של אנטיגנים וליצירת תגובות חיסוניות ארוכות טווח1. בנוסף לאלום האדג’ובנטי הקלאסי (מלח אלומיניום), ישנם שישה סוגים של אדג’ובנטים לחיסונים המשווקים כיום: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 ומטריצה-M5. בדרך כלל, כאשר גוף האדם נתקל בהתקפה ויראלית, קווי ההגנה הראשון והשני (עור, רירית ומקרופאגים) לוקחים את ההובלה בניקוי הנגיף, ולבסוף, קו ההגנה השלישי, הכולל את איברי החיסון ותאי החיסון, מופעל. מלחי אלומיניום ואלומיניום הם האדג’ובנטים הנפוצים ביותר לחיסונים אנושיים מאז תחילת שנות ה-20 של המאה ה-20, מה שמעורר תגובה חיסונית מולדת יעילה6. עם זאת, הוצע כי הפעלת תאים המציגים אנטיגן (APCs) על ידי אדג’ובנטים קלאסיים, אשר מגרה את תאי החיסון ליצור קבוצות ספציפיות של ציטוקינים וכמוקינים, היא המנגנון שבאמצעותו אדג’ובנטים פועלים ועשויה להיות אחת הסיבות לכך שאדג’ובנטים מפעילים רק השפעות חולפות על תגובות חיסוניות ספציפיות7. נוכחותם של אדג’ובנטים מורשים מוגבלים לשימוש אנושי היא גורם מגביל לפיתוח חיסונים המעוררים תגובות חיסוניות יעילות8.
כיום, מספר גדל והולך של מחקרים אדג’ובנטיים מדגימים את היכולת לגרום לתגובה חיסונית תאית חזקה בעכברים. הוכח כי QS-21 משרה תגובה חיסונית מאוזנת של T-helper 1 (Th1) ו-T-helper 2 (Th2), מייצר רמות גבוהות יותר של טיטרים של נוגדנים ומאריך את ההגנה כאדג’ובנט, אך רעילותו החזקה ותכונותיו ההמוליטיות מגבילות את התפתחותו כאדג’ובנט קליניעצמאי 9,10. OP-D (רוסקוגנין-O-α-L-ראמנופירנוזיל1-(1→2)-β-D-קסילופירנוזיל-(1→3)-β-D-fucopyranoside) הוא אחד הספונינים הסטרואידים שבודדו משורש צמח המרפא הסיני Ophiopogon japonicas4. בנוסף, זהו המרכיב הפרמקולוגי הפעיל העיקרי (שן מאי סאן) שנמצא ברדיקס אופיופוגוניס וידוע כבעל תכונות פרמקולוגיות מסוימות11. יתר על כן, הוא חבר במשפחת Liliaceae והוא נמצא בשימוש נרחב עבור ההשפעות המעכבות והמגינות שלו בדלקת תאית ופגיעה בשריר הלב. לדוגמה, OP-D משמיד נגעים דמויי אטופיק דרמטיטיס המושרים על-ידי DNCB ותאי HaCaT דלקתיים של גורם נמק הגידול אלפא (TNF-α) בעכברי BALB/c12. חשוב לציין כי OP-D מקדם את ההגנה נוגדת החמצון של מערכת הלב וכלי הדם ומגן על הלב מפני פגיעה אוטופגית הנגרמת על ידי דוקסורוביצין על ידי הפחתת ייצור מיני חמצן תגובתי ושיבוש הנזק לממברנה המיטוכונדריאלית. ניסויים הראו כי נטילת OP-D עם מונו-דסמוזיד עוזרת לשפר את בריאות מערכת החיסון, להגביר את ספירת תאי הדם הלבנים ואת סינתזת הדנ”א, ולגרום לנוגדנים להחזיק מעמד זמן רב יותר13. בעבר נמצא כי OP-D יש אפקט אדג’ובנטי14.
ננו-מולקולות הן ננו-מולקולות שמן במים המורכבות משילוב של חומרים פעילי שטח, נפט, חומרים פעילי שטח ומים12,15. עיצובים אלה של ננו-חיסונים מאפשרים לעטוף אנטיגנים ואדג’ובנטים יחד כדי להגביר את הגירוי החיסוני, להגן על האנטיגנים ולקדם התבגרות של תאים דנדריטיים (DC)16. לצורך פיתוח של אדג’ובנטים חדשניים אלה המתקבלים מהקרנה, חשוב למצוא שיטות מתאימות להערכת יכולות התגובה התאית שלהם.
מטרת פרוטוקול זה היא להעריך באופן שיטתי אם אדג’ובנטים יכולים לשפר את הפאגוציטוזה ואת הביטוי של תאי מערכת החיסון בתרבית תאים במבחנה ולפרט על שיטות הניסוי העיקריות. הניסוי מחולק לארבעה סעיפי משנה: (1) הרעילות של OP-D ו-NOD לתאי L929 נקבעת על ידי בדיקת ערכת ספירת התאים 8 (CCK-8); (2) רמות הציטוקינים של IFN-γ ו-IL-17A האנדוקריניים ומספרי התאים המתאימים בעכברים מחוסנים מזוהים על ידי גירוי ספלנוציטים ומבחני ELISpot; (3) יכולת הצגת האנטיגן של DCs לאחר גירוי אדג’ובנטי נצפית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית; ו-(4) מזוהים שלושת סוגי הציטוקינים, IL-1β, IL-6 ו-TNF-α, בסופרנטנטים המתקבלים ממקרופאגים של הצפק (PMs) בעכברים רגילים שעברו התרבות יחד עם אדג’ובנטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיסונים תת-יחידות מספקים בטיחות מצוינת אך אימונוגניות ירודה. האסטרטגיה העיקרית לשיפור האימונוגניות היא לספוח פיזית או להצמיד אנטיגנים עם אדג’ובנטים ולשלב אותם במערכות אספקת התרופות כדי לקדם את הקליטה וההצגה על ידי DCs. ספונינים צמחיים טבעיים כגון quillaia saponin ונגזרותיו הם רעילים מאוד ואינם מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מס ‘2021YFC2302603 של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין, מענקים מס ‘31670938, 32070924, 82041045 ו- 32000651 של תוכנית הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מענקים מס ‘ 2014jcyjA0107 ומס ‘ 2019jcyjA-msxmx0159 של תוכנית פרויקט הקרן למדעי הטבע של צ’ונגצ’ינג, מענק מס ‘CYS21519 של פרויקט המחקר והחדשנות לתואר שני של צ’ונגצ’ינג, מענק מס ‘2020XBK24 של פרויקטים מיוחדים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית, ומענק מס ‘202090031021 של התוכנית הלאומית לחדשנות ויזמות לסטודנטים במכללה.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
