Summary

In vitro Valutazione dell'attività cellulare del vaccino adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Il protocollo presenta metodi dettagliati per valutare se l’adiuvante nanoemulsione ofiopogonina D promuove risposte immunitarie cellulari efficaci.

Abstract

Come ingrediente principale dei vaccini, gli adiuvanti possono indurre o migliorare direttamente le risposte immunitarie potenti, diffuse, innate e adattative associate agli antigeni. Ophiopogonin D (OP-D), un componente purificato estratto dalla pianta Ophiopogon japonicus, è stato trovato utile come adiuvante del vaccino. I problemi della bassa solubilità e tossicità dell’OP-D possono essere efficacemente superati utilizzando un metodo di emulsificazione a bassa energia per preparare la nanoemulsione ofiopogonina D (NOD). In questo articolo vengono esaminati una serie di protocolli in vitro per la valutazione dell’attività cellulare. Gli effetti citotossici di L929 sono stati determinati utilizzando un test kit-8 per il conteggio delle cellule. Quindi, i livelli di citochine secreti e il corrispondente numero di cellule immunitarie dopo la stimolazione e la coltura di splenociti da topi immunizzati sono stati rilevati con metodi ELISA ed ELISpot. Inoltre, la capacità di assorbimento dell’antigene nelle cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC), che sono state isolate da topi C57BL / 6 e maturate dopo l’incubazione con GM-CSF più IL-4, è stata osservata mediante microscopia confocale a scansione laser (CLSM). È importante sottolineare che l’attivazione dei macrofagi è stata confermata misurando i livelli di IL-1β, IL-6 e citochine del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) mediante kit ELISA dopo aver cocoltivato macrofagi peritoneali (PM) da topi bianchi con l’adiuvante per 24 ore. Si spera che questo protocollo fornirà ad altri ricercatori approcci sperimentali diretti ed efficaci per valutare l’efficacia della risposta cellulare di nuovi adiuvanti vaccinali.

Introduction

I vaccini sono un mezzo importante per prevenire e curare le malattie infettive e non trasmissibili. L’aggiunta appropriata di adiuvanti e veicoli di somministrazione alle formulazioni dei vaccini è utile per migliorare l’immunogenicità degli antigeni e generare risposte immunitarie durature1. Oltre al classico allume adiuvante (sale di alluminio), ci sono sei tipi di adiuvanti per i vaccini che sono attualmente commercializzati: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Generalmente, quando il corpo umano incontra un attacco virale, la prima e la seconda linea di difesa (pelle, mucosa e macrofagi) prendono il comando nell’eliminazione del virus e, infine, viene attivata la terza linea di difesa, che coinvolge gli organi immunitari e le cellule immunitarie. L’alluminio e i sali di alluminio sono stati gli adiuvanti più utilizzati per i vaccini umani sin dai primi anni 1920, suscitando un’efficace risposta immunitaria innata6. Tuttavia, è stato proposto che l’attivazione delle cellule presentanti l’antigene (APC) da parte degli adiuvanti classici, che stimola le cellule immunitarie a generare serie specifiche di citochine e chemochine, è il meccanismo attraverso il quale funzionano gli adiuvanti e può essere uno dei motivi per cui gli adiuvanti esercitano solo effetti transitori su specifiche risposte immunitarie7. La presenza di adiuvanti autorizzati limitati per uso umano è un fattore restrittivo per lo sviluppo di vaccini che suscitano risposte immunitarie efficaci8.

Attualmente, un numero crescente di studi adiuvanti sta dimostrando la capacità di indurre una forte risposta immunitaria cellulare nei topi. QS-21 ha dimostrato di indurre una risposta immunitaria bilanciata T-helper 1 (Th1) e T-helper 2 (Th2), produrre livelli più elevati di titoli anticorpali e prolungare la protezione come adiuvante, ma la sua forte tossicità e le proprietà emolitiche limitano il suo sviluppo come adiuvante clinico autonomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopyranoside) è una delle saponine steroidee isolate dalla radice della pianta medicinale cinese Ophiopogon japonicas4. Inoltre, è il principale componente farmacologicamente attivo (Shen Mai San) trovato in Radix Ophiopogonis ed è noto per avere alcune proprietà farmacologiche11. Inoltre, è un membro della famiglia delle Liliaceae ed è ampiamente utilizzato per i suoi effetti inibitori e protettivi nell’infiammazione cellulare e nel danno miocardico. Ad esempio, OP-D migliora le lesioni simili alla dermatite atopica indotte da DNCB e le cellule HaCaT infiammatorie del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) nei topi BALB / c12. È importante sottolineare che OP-D promuove la protezione antiossidante del sistema cardiovascolare e protegge il cuore dal danno autofagico indotto dalla doxorubicina riducendo sia la generazione di specie reattive dell’ossigeno che interrompendo il danno alla membrana mitocondriale. Gli esperimenti hanno dimostrato che l’assunzione di OP-D con mono-desmoside aiuta a migliorare la salute immunitaria, aumentare la conta dei globuli bianchi e la sintesi del DNA e far durare più a lungo gli anticorpi13. In precedenza è stato riscontrato che l’OP-D ha un effetto adiuvante14.

Le nanoemulsioni sono nanoformulazioni olio-in-acqua composte da una combinazione di tensioattivi, olio, tensioattivi e acqua12,15. Questi progetti di nanovaccini consentono di incapsulare insieme antigeni e adiuvanti per migliorare la stimolazione immunitaria, proteggere gli antigeni e promuovere la maturazione delle cellule dendritiche (DC)16. Per lo sviluppo di questi nuovi adiuvanti ottenuti dallo screening, è importante trovare metodi appropriati per valutare le loro capacità di risposta cellulare.

Lo scopo di questo protocollo è quello di valutare sistematicamente se gli adiuvanti possono migliorare la fagocitosi e l’espressione di cellule immunitarie in colture cellulari in vitro e di elaborare i principali metodi sperimentali. L’esperimento è diviso in quattro sottosezioni: (1) la tossicità di OP-D e NOD per le cellule L929 è determinata dal test del kit-8 (CCK-8) per il conteggio delle cellule; (2) i livelli di citochine di IFN-γ endocrino e IL-17A e il numero di cellule corrispondenti nei topi immunizzati sono rilevati mediante stimolazione degli splenociti e saggi ELISpot; (3) la capacità di presentazione dell’antigene delle DC dopo stimolazione adiuvante è osservata utilizzando la microscopia confocale; e (4) vengono rilevati i tre tipi di citochine, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nei supernatanti ottenuti da macrofagi peritoneali (PM) in topi normali in cocoltura con adiuvanti.

Protocol

Tutti gli esperimenti sulle cellule sono stati eseguiti in un laboratorio di ingegneria cellulare dotato di sale operatorie di base, sale tampone, sale di coltura sterili e sale di identificazione e analisi. L’ambiente e le condizioni di lavoro erano privi di contaminazione microbica e altri fattori dannosi. Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sulla base delle linee guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio della…

Representative Results

La valutazione dell’attività cellulare degli adiuvanti OP-D e NOD è stata completata in vitro secondo il protocollo. I fibroblasti L929 sono un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro di NOD (Figura 1). La quantificazione dei livelli di citochine infiammatorie nella milza può aiutare i ricercatori a comprendere meglio la risposta immunitaria (Figura 2). Il monitoraggio dei CTL con ELISpot è il gold standard per valutare…

Discussion

I vaccini a subunità forniscono un’eccellente sicurezza ma scarsa immunogenicità. La strategia principale per migliorare l’immunogenicità consiste nell’assorbire fisicamente o accoppiare gli antigeni con adiuvanti e incorporarli nei sistemi di somministrazione dei farmaci per promuovere l’assorbimento e la presentazione da parte delle DC. Le saponine vegetali naturali come la saponina di quillaia e i suoi derivati sono altamente tossiche e non sono adatte allo sviluppo di vaccini umani17. Perta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione n. 2021YFC2302603 del National Key Research and Development Program of China, sovvenzioni n. 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 del National Natural Science Foundation Program of China, sovvenzioni n. 2014jcyjA0107 e n. 2019jcyjA-msxmx0159 del Natural Science Foundation Project Program di Chongqing, sovvenzione n. CYS21519 del Progetto di ricerca e innovazione post-laurea di Chongqing, sovvenzione n. 2020XBK24 dei progetti speciali dell’Università medica dell’esercito e sovvenzione n. 202090031021 del Programma nazionale di innovazione e imprenditorialità per studenti universitari.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA (1x) GIBCO, USA 25200056
96-well filter plates Millipore. Billerica, MA CLS3922
AlPO4 General Chemical Company, USA null
Automated Cell Counter Countstar, China IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd null
caprylic/capric triglyceride (GTCC) Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China null
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Cell Counting Plate Costar, Corning, USA CO010101
Cell Sieve biosharp, China BS-70-CS
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
DMEM basic(1x) medium GIBCO, USA C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35) Mumbai, India null
ELISpot classic AID, Germany ELR06
Fetal Bovine Serum GIBCO, USA 10099141C
Full-function Microplate Reader Thermo Fisher Scientific, USA VL0000D2
GFP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P42212
Glutamax Invitrogen, USA 35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor GM-CSF, R&D Systems, USA 315-03
HEPES Invitrogen, USA 15630106
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland null
IL-4 PeproTech, USA 042149
L929 cell line FENGHUISHENGWU, China  NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss, Germany LSM 980
MONTANE 85 PPI SEPPIC, France L12910
MONTANOX 80 PPI SEPPIC, France 36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit Dakewe, China 1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit Dakewe, China DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit Dakewe, China 1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit ebiosciences, USA 3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit Dakewe, China 1210122
Mouse IL-6 ELISA kit Dakewe, China 1210602
Mouse TNF-α ELISA kit Dakewe, China 1217202
Non-essential amino acids(100x) Invitrogen, USA 11140050
Ophiopogonin-D Chengdu Purui Technology Co. Ltd 945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution Invitrogen, USA 15070063
Phalloidin Solarbio, China CA1620
Phosphate Buffered Saline ZSGB-BIO, China ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer Solarbio, China R1010
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology), USA SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM) Invitrogen, USA 11360070
Squalene Sigma, USA S3626
β- Mercaptoethanol Invitrogen, USA 21985023

References

  1. Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
  2. Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
  3. Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
  4. Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
  5. Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years – United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
  6. Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
  7. Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
  8. Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
  9. Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
  10. Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
  11. Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
  12. An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
  13. Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
  14. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  15. Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
  16. Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D’ in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
  17. Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
  18. Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
  19. Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
  20. Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
  21. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
  22. Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
  23. Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
  24. Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
  25. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  26. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  27. Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
  28. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Frontiers in Bioscience. 13, 453-461 (2008).
  29. Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).

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Luo, X., Tong, Y., Zeng, X., Ye, Y., Yang, Y., Song, Z., Zhang, Z., Li, H., Gao, J., Mao, X., Zeng, H., Zou, Q., Sun, H. In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D. J. Vis. Exp. (190), e64291, doi:10.3791/64291 (2022).

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