Déchiffrer le mécanisme moléculaire et la fonction des toxines formant des pores à l’aide de Leishmania major
Summary
Un protocole utilisant des promastigotes majeurs de Leishmania est présenté ici pour déterminer la liaison, la cytotoxicité et la signalisation induites par les toxines formant des pores. Une preuve de concept avec la streptolysine O est fournie. D’autres toxines peuvent également être utilisées pour tirer parti des mutants génétiques disponibles chez L. major afin de définir de nouveaux mécanismes de résistance aux toxines.
Abstract
Comprendre la fonction et le mécanisme des toxines formant des pores (PFT) est difficile parce que les cellules résistent aux dommages membranaires causés par les PFT. Bien que les approches biophysiques aident à comprendre la formation des pores, elles reposent souvent sur des approches réductionnistes dépourvues du complément complet de lipides et de protéines membranaires. Les cellules humaines cultivées fournissent un système alternatif, mais leur complexité et les redondances dans les mécanismes de réparation rendent difficile l’identification de mécanismes spécifiques. En revanche, le protozoaire humain pathogène responsable de la leishmaniose cutanée, Leishmania major, offre un équilibre optimal entre complexité et pertinence physiologique. L. major est génétiquement traitable et peut être cultivé à haute densité in vitro, et tout impact des perturbations sur l’infection peut être mesuré dans des modèles murins établis. De plus, L. major synthétise des lipides distincts de leurs homologues mammifères, ce qui pourrait modifier la dynamique membranaire. Ces altérations de la dynamique membranaire peuvent être sondées avec des PFT de la famille de toxines la mieux caractérisée, les cytolysines dépendantes du cholestérol (CDC). Les CDC se lient à l’ergostérol dans la membrane de Leishmania et peuvent tuer les promastigotes de L. major, ce qui indique que L. major est un système modèle approprié pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires de la fonction PFT. Ce travail décrit les méthodes de test de la fonction PFT chez les promastigotes de L. major, y compris la culture de parasites, les outils génétiques pour évaluer la sensibilité aux lipides, les tests de liaison membranaire et les tests de mort cellulaire. Ces essais permettront l’utilisation rapide de L. major en tant que système modèle puissant pour comprendre la fonction PFT à travers une gamme d’organismes évolutifs divers et de points communs dans l’organisation des lipides.
Introduction
Les toxines formant des pores (PFT) constituent la plus grande famille de toxines bactériennes1, mais les mécanismes par lesquels elles perforent et détruisent les cellules sont mal compris. La famille de toxines formant des pores la mieux étudiée est celle des cytolysines dépendantes du cholestérol (CDC). Les CDC sont principalement synthétisés par des bactéries à Gram positif, y compris l’agent causal de la fasciite nécrosante, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes sécrète la streptolysine O (SLO) du CDC, qui se lie aux stérols dans la membrane plasmique des cellules hôtes sous forme de monomères, oligomérise et insère ~20-30 nm pores dans la membrane1. Le rôle que jouent les lipides dans ce processus reste mal déterminé.
Une approche pour étudier les interactions lipides-CDC est l’utilisation de liposomes chimiquement définis. Bien que les liposomes définis fournissent des informations sur les seuils de lipides nécessaires pour soutenir la liaison aux toxines et la formation de pores3,4, ils ne récapitulent pas complètement les fonctions cellulaires. Par exemple, les liposomes reconstitués n’ont pas l’asymétrie lipidique des hôtes mammifères et les modifications lipidiques en réponse aux toxines5. Une alternative aux liposomes consiste à utiliser des lignées cellulaires de mammifères. Bien que ces lignées cellulaires soient plus pertinentes sur le plan physiologique, il existe un degré élevé de redondance dans les mécanismes de détection des toxines et de résistance2. En conséquence, les voies de réparation utilisées pour résister aux CDC restent mal déterminées. Notamment, l’afflux de Ca2+ est le principal activateur de la réparation membranaire1. En aval de l’afflux de Ca2+, de multiples voies sont engagées, y compris une réparation dépendante des céramides 6,7 et une voie de réparation dépendante de MEK6. Ces voies interagissent avec d’autres effecteurs protéiques, y compris le complexe de tri endosomal nécessaire au transport (ESCRT)8 et les annexines 6,9,10. La dissection de ces voies dans les cellules de mammifères est difficile en raison de la redondance, qui brouille l’interprétation des données.
Une façon d’équilibrer la complexité et la simplicité pour disséquer les voies de réparation est l’utilisation d’organismes plus simples, tels que les pathogènes protozoaires du genre Leishmania. Leishmania sp. cause la leishmaniose chez les humains et d’autres animaux. La leishmaniose va de la leishmaniose cutanée (lésions cutanées spontanément résolutives) à la leishmaniose viscérale mortelle (hépatosplénomégalie), selon l’espèce et d’autres facteurs11. Leishmania major, l’agent causal de la leishmaniose cutanée, est transmis à l’homme via un vecteur phlébotome et est utilisé pour comprendre la fonction et l’infection de Leishmania 12. De plus, Leishmania sp. sont digéniques12. Ils existent sous forme de parasites macrophages mammifères intracellulaires appelés amastigotes et de promastigotes flagellés nageant librement chez le phlébotome12. Les promastigotes de L. major peuvent être cultivés dans des milieux supplémentés en sérum tels que M199 à haute densité13. Les promastigotes sont également génétiquement traitables; Il existe de nombreux gènes knockouts, y compris ceux ciblant les voies de biosynthèse des lipides13. Ces knockouts peuvent être évalués pour la croissance et les différences dans l’infectiosité et le développement de lésions via l’infection de souris Balb / c13.
En plus de la facilité relative de la culture de Leishmania et de la gamme des knockouts de biosynthèse lipidique, le parasite a un génome plus simple que les mammifères. L’espèce de Leishmania la mieux caractérisée est L. major, qui possède de nombreux outils génétiques existants, tels que des mutants avec un métabolisme lipidique défectueux14. Notamment, de nombreuses protéines de réparation sont absentes. L. major n’a pas d’homologues identifiés à ce jour pour les protéines de réparation des mammifères clés telles que les annexines. Cela permet de caractériser les voies de réparation conservées au cours de l’évolution sans la complexité des systèmes de mammifères. Cependant, les voies de réparation n’ont pas été caractérisées à Leishmania à ce jour. Dans le même temps, les principales voies de signalisation impliquées dans la réparation, telles que la voie MEK6, sont conservées dans Leishmania sp.15,16, bien que les homologues doivent être validés. La voie de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) est bien étudiée chez L. mexicana, où elle contribue à la survie intracellulaire et à la thermostabilité dans les cellules de mammifères et contrôle la métacyclogenèse16. Chez Leishmania sp., 10 des 15 MAPK ont été caractérisés17. LmMAPK9 et LmMAPK13 devraient être les plus semblables aux mammifères ERK1/2 d’après l’identité dans la séquence labiale de phosphorylation conservée. La séquence de phosphorylation des lèvres est TEY pour les mammifères ERK1/2 et LmMAPK9 et LmMAPK13. Cependant, huit des MAPK de Leishmania ont un motif de phosphorylation TDY15. Au moins deux homologues de MEK ont été identifiés dans Leishmania sp., LmxMKK18 et MEKK-related kinase (MRK1)19. Cela suggère que les idées identifiées dans Leishmania pourraient se traduire dans les systèmes de mammifères. Lorsqu’ils ne se traduisent pas dans les systèmes mammifères, ils représentent des cibles thérapeutiques pour le traitement de la leishmaniose.
Afin d’utiliser les promastigotes de L. major pour étudier la réparation membranaire et les interactions avec les toxines, des techniques à débit moyen sont nécessaires. Bien que l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution permette de visualiser les protéines et les membranes marquées en temps réel, elle est à faible débit et peut ne pas mesurer la survie cellulaire. Les tests de viabilité à débit moyen comprennent l’absorption de colorants mesurée par cytométrie en flux, la mesure de l’activité mitochondriale ou la libération de protéines cellulaires comme la lactate déshydrogénase (LDH). Dans les cellules de mammifères, les tests LDH ne mesurent pas quantitativement la mort cellulaire20. De plus, les tests basés sur la population comme la libération de LDH ou l’activité mitochondriale ne permettent pas une analyse monocellulaire ou multiparamétriquerobuste 20. En revanche, les tests basés sur la cytométrie en flux permettent une analyse multiparamétrique d’une seule cellule20. Cependant, ces tests n’ont pas été appliqués à la compréhension de la biologie des toxines ou des réponses aux toxines chez L. major promastigotes.
Dans cette étude, le SLO est utilisé comme outil pour comprendre la perturbation de la membrane plasmique du mutant nul sphingolipide de L. major dans deux tampons différents – le milieu M199 couramment utilisé pour la culture de promastigotes de L. major et le tampon de Tyrode plus simple . Un essai de cytométrie en flux à débit moyen est décrit et utilisé pour générer des courbes dose-réponse de toxines. Les données du test de cytométrie en flux sont modélisées sur une courbe logistique pour déterminer les valeurs CL50 . Avec cette information, une dose sublytique de SLO peut être déterminée afin que les anticorps MAPK puissent être validés par transfert Western.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, des méthodes pour étudier les mécanismes moléculaires et les fonctions des PFT ont été décrites, en utilisant l’agent pathogène humain Leishmania major comme système modèle. Un test de cytotoxicité basé sur la cytométrie en flux à moyen débit pour mesurer la viabilité d’une cellule unique a été mis au point. La viabilité est quantitative au niveau de la population parce que les valeurs de CL50 peuvent être calculées à partir de la courbe dose-réponse à l?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les membres des laboratoires Keyel et Zhang pour leur examen critique du manuscrit. Les auteurs remercient le College of Arts and Sciences Microscopy pour l’utilisation des installations.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
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