Decifrare il meccanismo molecolare e la funzione delle tossine che formano i pori usando la Leishmania major
Summary
Presentato qui è un protocollo che utilizza Leishmania major promastigotes per determinare il legame, la citotossicità e la segnalazione indotta dalle tossine che formano i pori. Viene fornita una prova di concetto con streptolisina O. Altre tossine possono anche essere utilizzate per sfruttare i mutanti genetici disponibili in L. major per definire nuovi meccanismi di resistenza alle tossine.
Abstract
Comprendere la funzione e il meccanismo delle tossine che formano i pori (PFT) è difficile perché le cellule resistono al danno di membrana causato dai PFT. Mentre gli approcci biofisici aiutano a comprendere la formazione dei pori, spesso si basano su approcci riduzionisti privi del pieno complemento di lipidi e proteine di membrana. Le cellule umane coltivate forniscono un sistema alternativo, ma la loro complessità e ridondanza nei meccanismi di riparazione rendono difficile l’identificazione di meccanismi specifici. Al contrario, il patogeno protozoo umano responsabile della leishmaniosi cutanea, Leishmania major, offre un equilibrio ottimale tra complessità e rilevanza fisiologica. L. major è geneticamente trattabile e può essere coltivato ad alta densità in vitro, e qualsiasi impatto delle perturbazioni sull’infezione può essere misurato in modelli murini stabiliti. Inoltre, L. major sintetizza lipidi distinti dalle loro controparti dei mammiferi, che potrebbero alterare la dinamica della membrana. Queste alterazioni nella dinamica della membrana possono essere sondate con PFT della famiglia di tossine meglio caratterizzata, le citolisine colesterolo-dipendenti (CDC). I CDC si legano all’ergosterolo nella membrana della Leishmania e possono uccidere L. major promastigotes, indicando che L. major è un sistema modello adatto per determinare i meccanismi cellulari e molecolari della funzione PFT . Questo lavoro descrive i metodi per testare la funzione PFT in L. major promastigotes, tra cui coltura parassitaria, strumenti genetici per valutare la suscettibilità ai lipidi, saggi di legame della membrana e saggi di morte cellulare. Questi saggi consentiranno l’uso rapido di L. major come potente sistema modello per comprendere la funzione PFT in una serie di organismi evolutivamente diversi e punti in comune nell’organizzazione dei lipidi.
Introduction
Le tossine che formano i pori (PFT) sono la più grande famiglia di tossine batteriche1, ma i meccanismi con cui perforano e distruggono le cellule sono poco conosciuti. La famiglia meglio studiata di tossine che formano i pori è quella delle citolisine colesterolo-dipendenti (CDC). I CDC sono sintetizzati principalmente da batteri gram-positivi, incluso l’agente eziologico della fascite necrotizzante, Streptococcus pyogenes2. S. pyogenes secerne la streptolisina O CDC (SLO), che si lega agli steroli nella membrana plasmatica delle cellule ospiti come monomeri, oligomerizza e inserisce ~ 20-30 nm pori nella membrana1. Il ruolo che i lipidi svolgono in questo processo rimane scarsamente determinato.
Un approccio allo studio delle interazioni lipidi-CDC è l’uso di liposomi chimicamente definiti. Mentre i liposomi definiti forniscono informazioni sulle soglie necessarie dei lipidi per sostenere il legame delle tossine e la formazione dei pori3,4, non ricapitolano completamente le funzioni cellulari. Ad esempio, i liposomi ricostituiti mancano dell’asimmetria lipidica degli ospiti dei mammiferi e delle modificazioni lipidiche in risposta alle tossine5. Un’alternativa ai liposomi è quella di utilizzare linee cellulari di mammifero. Mentre queste linee cellulari sono fisiologicamente più rilevanti, c’è un ampio grado di ridondanza nei meccanismi di rilevamento e resistenza delle tossine2. Di conseguenza, i percorsi di riparazione utilizzati per resistere ai CDC rimangono scarsamente determinati. In particolare, l’afflusso di Ca2+ è l’attivatore primario della riparazione della membrana1. A valle dell’afflusso di Ca2+, sono impegnati più percorsi, tra cui un 6,7 di riparazione dipendente dalla ceramide e unpercorso di riparazione 6 dipendente da MEK. Queste vie interagiscono con altri effettori proteici, incluso il complesso di selezione endosomiale richiesto per il trasporto (ESCRT)8 e le annessine 6,9,10. Sezionare questi percorsi nelle cellule di mammifero è difficile a causa della ridondanza, che confonde l’interpretazione dei dati.
Un modo per bilanciare la complessità con la semplicità per sezionare i percorsi di riparazione è l’uso di organismi più semplici, come i patogeni protozoari del genere Leishmania. Leishmania sp. causa leishmaniosi negli esseri umani e in altri animali. La leishmaniosi varia dalla leishmaniosi cutanea (lesioni cutanee autolimitate) alla leishmaniosi viscerale fatale (epatosplenomegalia), a seconda della specie e di altri fattori11. La Leishmania major, l’agente eziologico della leishmaniosi cutanea, viene trasmessa agli esseri umani attraverso un vettore di sandfly e viene utilizzata per comprendere la funzione e l’infezione della Leishmania 12. Inoltre, Leishmania sp. sono digenici12. Esistono come parassiti macrofagi intracellulari dei mammiferi chiamati amastigoti e come promastigoti flagellati che nuotano liberamente nel sandfly12. L. i promastigoti maggiori possono essere coltivati in terreni integrati con siero come M199 ad alta densità13. I promastigoti sono anche geneticamente trattabili; Esistono molti knockout genici, compresi quelli che prendono di mira le vie di biosintesi lipidica13. Questi knockout possono essere valutati per la crescita e le differenze nell’infettività e nello sviluppo delle lesioni attraverso l’infezione di topi Balb / c13.
Oltre alla relativa facilità della coltura di Leishmania e alla gamma di knockout di biosintesi lipidica, il parassita ha un genoma più semplice rispetto ai mammiferi. La specie meglio caratterizzata di Leishmania è L. major, che ha molti strumenti genetici esistenti, come mutanti con metabolismo lipidico difettoso14. In particolare, molte proteine di riparazione sono assenti. L. major non ha omologhi identificati fino ad oggi per le proteine chiave di riparazione dei mammiferi come le annessine. Ciò consente la caratterizzazione di percorsi di riparazione evolutivamente conservati senza la complessità dei sistemi dei mammiferi. Tuttavia, i percorsi di riparazione non sono stati caratterizzati in Leishmania fino ad oggi. Allo stesso tempo, le vie di segnalazione chiave coinvolte nella riparazione, come la via MEK6, sono conservate in Leishmania sp.15,16, anche se gli omologhi devono essere convalidati. La via della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) è ben studiata in L. mexicana, dove contribuisce alla sopravvivenza intracellulare e alla termostabilità nelle cellule di mammifero e controlla la metaciclogenesi16. In Leishmania sp., 10 dei 15 MAPK sono stati caratterizzati17. Si prevede che LmMAPK9 e LmMAPK13 siano i più simili a ERK1/2 dei mammiferi in base all’identità nella sequenza labiale di fosforilazione conservata. La sequenza labiale di fosforilazione è TEY sia per ERK1/2 che per LmMAPK9 e LmMAPK13. Tuttavia, otto dei MAPK di Leishmania hanno un motivo di fosforilazione TDY15. Almeno due omologhi di MEK sono stati identificati in Leishmania sp., LmxMKK18 e MEKK-related kinase (MRK1)19. Ciò suggerisce che le intuizioni identificate in Leishmania potrebbero tradursi in sistemi di mammiferi. Dove non si traducono in sistemi di mammiferi, rappresentano bersagli terapeutici per il trattamento della leishmaniosi.
Per utilizzare L. major promastigotes per studiare la riparazione della membrana e le interazioni con le tossine, sono necessarie tecniche di media produttività. Mentre l’imaging di cellule vive ad alta risoluzione consente la visualizzazione di proteine e membrane marcate in tempo reale, è a basso rendimento e potrebbe non misurare la sopravvivenza cellulare. I saggi di vitalità a medio rendimento includono l’assorbimento del colorante misurato mediante citometria a flusso, la misurazione dell’attività mitocondriale o il rilascio di proteine cellulari come la lattato deidrogenasi (LDH). Nelle cellule di mammifero, i saggi LDH non misurano quantitativamente la morte cellulare20. Inoltre, i saggi basati sulla popolazione come il rilascio di LDH o l’attività mitocondriale non consentono una solida analisi monocellulare o multiparametrica20. Al contrario, i saggi basati sulla citometria a flusso consentono l’analisi multiparametrica di singole cellule20. Tuttavia, questi test non sono stati applicati alla comprensione della biologia delle tossine o delle risposte alle tossine in L. major promastigotes.
In questo studio, SLO è usato come strumento per comprendere la perturbazione della membrana plasmatica del mutante nullo sfingolipide di L. major in due diversi tamponi: il mezzo M199 abitualmente utilizzato per la coltura di L. major promastigotes e il più semplice tampone di Tyrode . Viene descritto un test di citometria a flusso a medio rendimento che viene utilizzato per generare curve dose-risposta delle tossine. I dati del saggio citometrico a flusso sono modellati su una curva logistica per determinare i valori di LC50 . Con queste informazioni, è possibile determinare una dose sublitica di SLO in modo che gli anticorpi MAPK possano essere convalidati utilizzando il western blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio sono stati descritti metodi per studiare i meccanismi molecolari e le funzioni dei PFT, utilizzando il patogeno umano Leishmania major come sistema modello. È stato sviluppato un saggio di citotossicità basato sulla citometria a flusso a media produttività per misurare la vitalità di una singola cellula. La vitalità è quantitativa a livello di popolazione perché i valori di LC50 possono essere calcolati dalla curva dose-risposta utilizzando la modellazione logistica. Come prova…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri dei laboratori Keyel e Zhang per la loro revisione critica del manoscritto. Gli autori ringraziano il College of Arts and Sciences Microscopy per l’uso delle strutture.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
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