Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek
Summary
Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major’da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.
Abstract
Gözenek oluşturan toksinlerin (PFT’ler) işlevini ve mekanizmasını anlamak zordur, çünkü hücreler PFT’lerin neden olduğu membran hasarına direnir. Biyofiziksel yaklaşımlar gözenek oluşumunu anlamaya yardımcı olurken, genellikle membran lipitlerinin ve proteinlerinin tam tamamlayıcısından yoksun indirgemeci yaklaşımlara güvenirler. Kültürlenmiş insan hücreleri alternatif bir sistem sağlar, ancak onarım mekanizmalarındaki karmaşıklıkları ve fazlalıkları, spesifik mekanizmaların tanımlanmasını zorlaştırır. Buna karşılık, kutanöz leishmaniasis’ten sorumlu insan protozoan patojeni Leishmania major, karmaşıklık ve fizyolojik ilişki arasında optimal bir denge sunar. L. major genetik olarak izlenebilir ve in vitro olarak yüksek yoğunluğa kadar kültürlenebilir ve pertürbasyonların enfeksiyon üzerindeki herhangi bir etkisi yerleşik murin modellerinde ölçülebilir. Ek olarak, L. major , membran dinamiklerini değiştirebilen memeli meslektaşlarından farklı lipitleri sentezler. Membran dinamiğindeki bu değişiklikler, en iyi karakterize toksin ailesinden, kolesterole bağımlı sitolisinlerden (CDC’ler) PFT’lerle araştırılabilir. CDC’ler Leishmania membranındaki ergosterol’e bağlanır ve L. majör promastigotları öldürebilir, bu da L. major’un PFT fonksiyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarını belirlemek için uygun bir model sistem olduğunu gösterir. Bu çalışma, parazit kültürü, lipit duyarlılığını değerlendirmek için genetik araçlar, membran bağlama testleri ve hücre ölümü tahlilleri dahil olmak üzere L. majör promastigotlarda PFT fonksiyonunu test etme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu analizler, L. major’un bir dizi evrimsel olarak farklı organizma ve lipit organizasyonundaki ortaklıklar arasında PFT fonksiyonunu anlamak için güçlü bir model sistem olarak hızlı bir şekilde kullanılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Gözenek oluşturan toksinler (PFT’ler), bakteriyel toksinlerin en büyük ailesidir1, ancak hücreleri deldikleri ve yok ettikleri mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. En iyi çalışılan gözenek oluşturan toksinler ailesi, kolesterole bağımlı sitolisinlerdir (CDC’ler). CDC’ler öncelikle nekrotizan fasiitin etken maddesi Streptococcus pyogenes2 dahil olmak üzere gram-pozitif bakteriler tarafından sentezlenir. S. pyogenes , konakçı hücrelerin plazma zarındaki sterollere monomerler olarak bağlanan, oligomerize olan ve membran1’e ~ 20-30 nm gözenekler ekleyen CDC streptolizin O’yu (SLO) salgılar. Lipitlerin bu süreçte oynadığı rol zayıf bir şekilde belirlenmiştir.
Lipid-CDC etkileşimlerini incelemeye yönelik bir yaklaşım, kimyasal olarak tanımlanmış lipozomların kullanılmasıdır. Tanımlanmış lipozomlar, toksin bağlanmasını vegözenek oluşumunu sürdürmek için gerekli lipit eşikleri hakkında bilgi sağlarken, hücresel fonksiyonları tam olarak özetlemezler. Örneğin, yeniden yapılandırılmış lipozomlar, memeli konakçılarının lipit asimetrisinden ve toksinlere yanıt olarak lipit modifikasyonlarından yoksundur5. Lipozomlara bir alternatif, memeli hücre hatlarını kullanmaktır. Bu hücre hatları fizyolojik olarak daha alakalı olsa da, toksin algılama ve direnç mekanizmalarında büyük ölçüde fazlalık vardır2. Sonuç olarak, CDC’lere direnmek için kullanılan onarım yolları zayıf bir şekilde belirlenmiştir. Özellikle, Ca2+ akışı, membran onarımı1’in birincil aktivatörüdür. Ca2+ akışının aşağı akışında, seramid bağımlı onarım 6,7 ve MEK’e bağımlı onarım yolu6 dahil olmak üzere birden fazla yoldevreye girer. Bu yollar, taşıma için gerekli endozomal sıralama kompleksi (ESCRT)8 ve ek 6,9,10 dahil olmak üzere diğer protein efektörleri ile etkileşime girer. Bu yolakların memeli hücrelerinde diseke edilmesi, veri yorumlamasını karıştıran fazlalık nedeniyle zordur.
Onarım yollarını incelemek için karmaşıklığı basitlikle dengelemenin bir yolu, Leishmania cinsindeki protozoan patojenler gibi daha basit organizmaların kullanılmasıdır. Leishmania sp. insanlarda ve diğer hayvanlarda leishmaniasis’e neden olur. Leishmaniasis, türlere ve diğer faktörlere bağlı olarak kutanöz leishmaniasis’ten (kendi kendini sınırlayan cilt lezyonları) ölümcül viseral leishmaniasis’e (hepatosplenomegali) kadar değişir11. Kutanöz leishmaniasisin etken maddesi olan Leishmania major, insanlara bir kum sineği vektörü aracılığıyla bulaşır ve Leishmania fonksiyonunu ve enfeksiyonunu anlamak için kullanılır12. Ek olarak, Leishmania sp. dijenik12’dir. Amastigotlar olarak adlandırılan hücre içi memeli makrofaj parazitleri ve kum sineği12’de serbest yüzen, kamçılı promastigotlar olarak bulunurlar. L. majör promastigotlar, M199 gibi serum takviyeli ortamlarda yüksek yoğunluklu13’e kadar kültürlenebilir. Promastigotlar ayrıca genetik olarak da izlenebilir; lipid biyosentez yollarını hedefleyenler de dahil olmak üzere birçok gen nakavtı vardır13. Bu nakavtlar, Balb / c farelerinin enfeksiyonu yoluyla büyüme ve enfeksiyon ve lezyon gelişimindeki farklılıklar açısından değerlendirilebilir13.
Leishmania kültürünün göreceli kolaylığına ve lipit biyosentez nakavtlarının aralığına ek olarak, parazit memelilerden daha basit bir genoma sahiptir. Leishmania’nın en iyi karakterize edilen türü, kusurlu lipit metabolizmasına sahip mutantlar gibi birçok mevcut genetik araca sahip olan L. major’dur 14. Özellikle, birçok onarım proteini yoktur. L. major, ekler gibi önemli memeli onarım proteinleri için bugüne kadar tanımlanmış homologlara sahip değildir. Bu, memeli sistemlerinin karmaşıklığı olmadan evrimsel olarak korunmuş onarım yollarının karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, Leishmania’da onarım yolları bugüne kadar karakterize edilmemiştir. Aynı zamanda, MEK yolu6 gibi onarımla ilgili anahtar sinyal yolakları Leishmania sp.15,16’da korunmaktadır, ancak homologların doğrulanması gerekmektedir. Mitojenle aktive edilen protein kinaz (MAPK) yolu, memeli hücrelerinde hücre içi sağkalım ve termostabiliteye katkıda bulunduğu ve metasiklogenezi kontrol ettiği L. mexicana’da iyi çalışılmıştır16. Leishmania sp.’de, 15 MAPK’dan 10’u17 olarak karakterize edilmiştir. LmMAPK9 ve LmMAPK13’ün, korunmuş fosforilasyon dudak dizisindeki kimliğe dayanarak memeli ERK1/2’ye en çok benzeyen olduğu tahmin edilmektedir. Fosforilasyon dudak dizisi hem memeli ERK1/2 hem de LmMAPK9 ve LmMAPK13 için TEY’dir. Bununla birlikte, Leishmania MAPK’ların sekizinde TDY fosforilasyon motifi15 vardır. Leishmania sp., LmxMKK18 ve MEKK ile ilişkili kinaz (MRK1)19’da en az iki MEK homologu tanımlanmıştır. Bu, Leishmania’da tanımlanan içgörülerin memeli sistemlerine dönüşebileceğini düşündürmektedir. Memeli sistemlerine tercüme edilmedikleri yerlerde, leishmaniasis tedavisi için terapötik hedefleri temsil ederler.
L. majör promastigotların membran onarımını ve toksinlerle etkileşimlerini incelemek için kullanılması için, orta verimli tekniklere ihtiyaç vardır. Yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme, etiketli proteinlerin ve membranların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlarken, düşük verimdir ve hücresel sağkalımı ölçmeyebilir. Orta verimli canlılık testleri, akış sitometrisi ile ölçülen boya alımını, mitokondriyal aktivitenin ölçümünü veya laktat dehidrogenaz (LDH) gibi hücresel proteinlerin salınımını içerir. Memeli hücrelerinde, LDH analizleri hücre ölümünü nicel olarak ölçmez20. Ayrıca, LDH salınımı veya mitokondriyal aktivite gibi popülasyon bazlı tahliller, sağlam tek hücreli veya multiparametrik analize izin vermez20. Buna karşılık, akış sitometrisine dayalı analizler multiparametrik tek hücreli analizi mümkün kılar20. Bununla birlikte, bu testler toksin biyolojisini veya L. majör promastigotlardaki toksinlere verilen yanıtları anlamak için uygulanmamıştır.
Bu çalışmada SLO, L. majör’ün sfingolipid null mutantının plazma membran pertürbasyonunu iki farklı tamponda anlamak için bir araç olarak kullanılmıştır – L. majör promastigotları ve daha basit Tyrode tamponunu kültürlemek için rutin olarak kullanılan M199 ortamı . Orta verimli bir akış sitometri testi tarif edilir ve toksin doz-yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılır. Akış sitometrik tahlilinden elde edilen veriler, LC50 değerlerini belirlemek için lojistik bir eğriye modellenir. Bu bilgiyle, MAPK antikorlarının batı lekelenmesi kullanılarak doğrulanabilmesi için sublitik bir SLO dozu belirlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, PFT’lerin moleküler mekanizmalarını ve fonksiyonlarını incelemek için kullanılan yöntemler, insan patojeni Leishmania major’u model bir sistem olarak kullanarak tanımlanmıştır. Tek hücreli canlılığı ölçmek için orta verimli bir akış sitometrisi tabanlı sitotoksisite testi geliştirilmiştir. LC50 değerleri lojistik modelleme kullanılarak doz-yanıt eğrisinden hesaplanabildiğinden, canlılık popülasyon düzeyinde nicelikseldir. Bir ilke kanıtı olarak, ort…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Keyel ve Zhang laboratuvarlarının üyelerine makaleyi eleştirel incelemeleri için teşekkür eder. Yazarlar, tesislerin kullanımı için Sanat ve Bilim Koleji Mikroskopisine teşekkür eder.
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases–Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G. Protein kinase involved in flagellar-length control. Eukaryotic Cell. 2 (4), 769-777 (2003).
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
