リーシュマニアメジャーを用いた細孔形成毒素の分子機構と機能の解明
Summary
ここに提示されるのは、孔形成毒素によって誘導される結合、細胞毒性、およびシグナル伝達を決定するために リーシュマニアの主要な 前鞭毛虫を使用するプロトコルです。ストレプトリジンOの概念実証が提供されます。他の毒素を使用して、 L.メジャー で利用可能な遺伝子変異体を活用して、毒素耐性の新しいメカニズムを定義することもできます。
Abstract
細胞はPFTによって引き起こされる膜損傷に抵抗するため、孔形成毒素(PFT)の機能とメカニズムを理解することは困難です。生物物理学的アプローチは細孔形成を理解するのに役立ちますが、膜脂質とタンパク質の完全な補体がない還元主義的アプローチに依存することがよくあります。培養ヒト細胞は代替システムを提供しますが、修復メカニズムの複雑さと冗長性により、特定のメカニズムを特定することは困難です。対照的に、皮膚リーシュマニア症の原因となるヒト原虫病原体である リーシュマニアメジャーは、複雑さと生理学的関連性の間の最適なバランスを提供します。 L. major は遺伝的に扱いやすく、 in vitroで高密度に培養することができ、感染に対する摂動の影響は、確立されたマウスモデルで測定できます。さらに、 L. major は哺乳類の対応するものとは異なる脂質を合成し、膜動態を変化させる可能性があります。膜動態におけるこれらの変化は、最も特徴付けられた毒素ファミリーであるコレステロール依存性サイトライシン(CDC)のPFTで調べることができます。CDCは リーシュマニア 膜のエルゴステロールに結合し、 L.メジャー 前鞭虫を殺すことができ、 L.メジャー がPFT機能の細胞および分子メカニズムを決定するための適切なモデルシステムであることを示しています。この研究では、寄生虫培養、脂質感受性を評価するための遺伝的ツール、膜結合アッセイ、および細胞死アッセイを含む、 L.主要な 前鞭毛虫のPFT機能を試験する方法について説明しています。これらのアッセイにより、進化的に多様な生物の範囲にわたるPFT機能および脂質組織の共通性を理解するための強力なモデルシステムとして L.メジャー を迅速に使用できるようになります。
Introduction
孔形成毒素(PFT)は細菌毒素の最大のファミリーですが1、それらが細胞を穿孔して破壊するメカニズムはよくわかっていません。最もよく研究されている細孔形成毒素のファミリーは、コレステロール依存性サイトライシン(CDC)のファミリーです。CDCは主に、壊死性筋膜炎の原因物質である化膿レンサ球菌2を含むグラム陽性菌によって合成されます。化膿菌はCDCストレプトリジンO(SLO)を分泌し、宿主細胞の原形質膜のステロールにモノマーとして結合し、オリゴマー化し、膜1に~20-30 nmの細孔を挿入します。このプロセスで脂質が果たす役割は、十分に決定されていないままです。
脂質-CDC相互作用を研究するための1つのアプローチは、化学的に定義されたリポソームの使用である。定義されたリポソームは、毒素結合と細孔形成を維持するために必要な脂質の閾値に関する情報を提供しますが3,4、細胞機能を完全には再現していません。例えば、再構成されたリポソームは、毒素に応答する哺乳動物宿主および脂質修飾の脂質非対称性を欠いている5。リポソームに代わる1つは、哺乳類細胞株を使用することである。これらの細胞株はより生理学的に関連性がありますが、毒素の感知と耐性のメカニズムには大きな冗長性があります2。結果として、CDCに抵抗するために使用される修復経路は十分に決定されていないままです。特に、Ca2+流入は膜修復の主要な活性化因子である1。Ca2+流入の下流には、セラミド依存性修復経路6,7およびMEK依存性修復経路6を含む複数の経路が関与している。これらの経路は、輸送に必要なエンドソームソーティング複合体(ESCRT)8、およびアネキシン6,9,10を含む他のタンパク質エフェクターと相互作用します。哺乳類細胞におけるこれらの経路を解剖することは、データの解釈を混乱させる冗長性のために困難である。
修復経路を解剖するための複雑さと単純さのバランスをとる1つの方法は、リーシュマニア属の原生動物病原体などのより単純な生物を使用することです。リーシュマニア属 人間や他の動物にリーシュマニア症を引き起こします。リーシュマニア症は、種やその他の要因に応じて、皮膚リーシュマニア症(自己限定性皮膚病変)から致命的な内臓リーシュマニア症(肝脾腫)までさまざまです11。皮膚リーシュマニア症の原因物質であるリーシュマニアメジャーは、サンドフライベクターを介してヒトに伝達され、リーシュマニアの機能と感染を理解するために使用されます12。また、リーシュマニア属は12遺伝子性である。それらは、アマスティゴテスと呼ばれる細胞内哺乳類マクロファージ寄生虫として、およびサンドフライ12の自由に泳ぐ鞭毛前鞭毛虫として存在します。L.主要な前鞭毛虫は、M199などの血清添加培地で高密度に培養することができます13。プロマスティゴテスも遺伝的に扱いやすいです。脂質生合成経路を標的とするものを含む多くの遺伝子ノックアウトが存在する13。これらのノックアウトは、Balb/cマウスの感染による感染力および病変発生の成長および差異について評価することができる13。
リーシュマニア培養の比較的容易さと脂質生合成ノックアウトの範囲に加えて、寄生虫は哺乳類よりも単純なゲノムを持っています。リーシュマニアの最も特徴的な種はL.メジャーであり、脂質代謝に欠陥のある突然変異体など、多くの既存の遺伝的ツールがあります14。特に、多くの修復タンパク質は存在しません。L. majorは、アネキシンなどの主要な哺乳類修復タンパク質についてこれまでに同定されたホモログを有していない。これにより、哺乳類システムの複雑さなしに、進化的に保存された修復経路の特性評価が可能になります。しかし、修復経路は今日までリーシュマニアでは特徴付けられていません。同時に、MEK経路6などの修復に関与する主要なシグナル伝達経路は、リーシュマニアsp.15,16に保存されていますが、ホモログを検証する必要があります。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)経路はL. mexicanaでよく研究されており、哺乳類細胞の細胞内生存と熱安定性に寄与し、メタサイクロジェネシスを制御します16。リーシュマニア属では、15個のMAPKのうち10個が特徴付けられています17。LmMAPK9およびLmMAPK13は、保存されたリン酸化リップ配列における同一性に基づいて、哺乳類ERK1/2に最も類似していると予測される。リン酸化リップ配列は、哺乳類のERK1/2およびLmMAPK9およびLmMAPK13の両方でTEYです。しかしながら、リーシュマニアMAPKのうち8つはTDYリン酸化モチーフ15を有する。リーシュマニア属では、MEKの少なくとも2つのホモログ、LmxMKK18およびMEKK関連キナーゼ(MRK1)19が同定されています。これは、リーシュマニアで特定された洞察が哺乳類のシステムに変換できることを示唆しています。それらが哺乳類系に変換されない場合、それらはリーシュマニア症を治療するための治療標的を表す。
L. major promastigotesを使用して膜修復および毒素との相互作用を研究するためには、中程度のスループット技術が必要です。高解像度のライブセルイメージングは、標識されたタンパク質や膜をリアルタイムで可視化することができますが、スループットが低く、細胞の生存率を測定しない可能性があります。ミディアムスループット生存率アッセイには、フローサイトメトリーによる色素取り込みの測定、ミトコンドリア活性の測定、または乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)などの細胞タンパク質の放出が含まれます。哺乳動物細胞では、LDHアッセイは細胞死を定量的に測定しない20。さらに、LDH放出やミトコンドリア活性などの集団ベースのアッセイでは、堅牢なシングルセルまたはマルチパラメトリック分析はできません20。対照的に、フローサイトメトリーベースのアッセイは、マルチパラメトリックシングルセル解析を可能にします20。しかし、これらのアッセイは、L.主要な前鞭毛虫の毒素生物学または毒素に対する応答の理解には適用されていません。
この研究では、SLOは、L.メジャーの前鞭毛虫の培養に日常的に使用されているM199培地とより単純なTyradeバッファーの2つの異なるバッファーにおけるL.メジャーのスフィンゴ脂質ヌル変異体の原形質膜摂動を理解するためのツールとして使用されます。ミディアムスループットフローサイトメトリーアッセイが説明され、毒素の用量反応曲線を生成するために使用されます。フローサイトメトリーアッセイからのデータは、LC50値を決定するためにロジスティック曲線にモデル化されます。この情報を使用して、SLOのサブライティック用量を決定し、ウェスタンブロッティングを使用してMAPK抗体を検証できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ヒト病原体 リーシュマニアメジャー をモデル系として、PFTの分子メカニズムと機能を研究する方法について説明しました。単一細胞生存率を測定するためのミディアムスループットフローサイトメトリーベースの細胞毒性アッセイが開発されました。LC50 値はロジスティックモデリングを使用して用量反応曲線から計算できるため、生存率は集団レベルで定量的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、原稿の批判的レビューに対してKeyelとZhangの研究室のメンバーに感謝したいと思います。著者らは、施設の使用について教養学部顕微鏡法に感謝します。
Materials
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2–/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2–) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
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