Summary
Здесь рыбки данио-рерио (Danio rerio) используются в качестве модели для изучения аллергических реакций и иммунных реакций, связанных с синдромом альфа-Гал (AGS), путем оценки аллергических реакций на слюну клещей и потребление мяса млекопитающих.
Abstract
Клещи являются членистоногими переносчиками, которые вызывают заболевание путем передачи патогенов и чьи укусы могут быть связаны с аллергическими реакциями, влияющими на здоровье человека во всем мире. У некоторых людей высокие уровни антител иммуноглобулина Е против гликана Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) были вызваны укусами клещей. Анафилактические реакции, опосредованные гликопротеинами и гликолипидами, содержащими гликан α-Gal, присутствующий в слюне клеща, связаны с синдромом альфа-Гала (AGS) или аллергией на мясо млекопитающих. Рыбки данио-рерио (Danio rerio) стали широко используемой моделью позвоночных для изучения различных патологий. В этом исследовании рыбки данио-рерио использовались в качестве модели для изучения аллергических реакций в ответ на потребление α-Gal и мяса млекопитающих, поскольку, как и люди, они не синтезируют этот гликан. С этой целью оценивали поведенческие паттерны и геморрагические аллергические реакции анафилактического типа в ответ на слюну клеща Ixodes ricinus и потребление мяса млекопитающими. Этот экспериментальный подход позволяет получить достоверные данные, подтверждающие животную модель рыбок данио, для изучения клещевой аллергии, включая AGS.
Introduction
Клещи являются переносчиками патогенов, вызывающих заболевания, а также являются причиной аллергических реакций, влияющих на здоровье людей и животных во всем мире 1,2. Во время кормления клещей биомолекулы в слюне клеща, особенно белки и липиды, облегчают питание этих эктопаразитов, избегая защиты хозяина3. Некоторые биомолекулы слюны с модификациями гликана Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) приводят к выработке высоких уровней антител IgE против α-Gal после укуса клеща только у некоторых людей, что известно как синдром α-Gal (AGS)4. Это заболевание, связанное с IgE-опосредованной аллергией, которая может привести к анафилаксии к укусам клещей, потреблению мяса млекопитающих, не приматов, и некоторым лекарствам, таким как цетуксимаб5. Реакции на α-Gal часто бывают тяжелыми и иногда могут привести к летальному исходу 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-Gal встречается у всех млекопитающих, за исключением обезьян Старого Света, человекообразных обезьян и людей, которые не обладают способностью синтезировать α-Gal13. Однако патогены, такие как бактерии и простейшие, экспрессируют этот гликан на своей поверхности, что может индуцировать выработку большого количества антител IgM/IgG против α-Gal и может быть защитным механизмом против этих патогенов16,17. Однако выработка антител против α-Gal увеличивает риск развития IgE-опосредованной аллергии на α-Gal 7,13. Естественные антитела к α-Gal, продуцируемые в организме человека, в основном подтипов IgM/IgG, могут быть связаны с этой модификацией, присутствующей в бактериях из микробиотыкишечника 16. АГС может быть сложным клиническим диагнозом, поскольку основной диагностический метод в настоящее время основан на истории болезни отсроченных аллергических реакций, особенно связанных с пищевой аллергией (т.е. зудом, локализованной крапивницей или рецидивирующим ангионевротическим отеком до анафилаксии, крапивницы и желудочно-кишечных симптомов) и измерением уровней антител IgE к α-Gal9. Текущие данные свидетельствуют о том, что укусы клещей представляют собой один из основных рисков при появлении АГС 18,19, 20-кратное или более повышение уровня IgE до α-Gal после укуса клеща 19, укусы клещей в анамнезе у пациентов с АГС20,21,22, наличие антител, реагирующих на клещевые антигены у пациентов с АГС 19, и что анти-α-Gal IgE тесно связаны с уровнями антиклещевого IgE19,23, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы оценить, какие биомолекулы на самом деле участвуют.
Кроме того, другим возможным сценарием являются пациенты, которые проявляют сильные аллергические реакции на укусы клещей и высокий уровень антител IgE к α-Gal, но толерантны к потреблению мяса млекопитающих12. Таким образом, аллергия на мясо млекопитающих может быть особым типом аллергии, связанной с укусом клеща. Основные виды клещей, ассоциированные с AGS, включают Amblyomma americanum (США), Amblyomma sculptum (Бразилия), Amblyomma testudinarium и Haemaphysalis longicornis (Япония), Ixodes holocyclus ( Австралия) и Ixodes ricinus (основной переносчик боррелиоза Лайма в Европе)11,24.
Единственной моделью, которая использовалась для оценки продукции IgE, связанной с укусами клещей, является мышиная модель, генетически модифицированная геном для мышей с нокаутом α-1,3-галактозилтрансферазы (α-Gal KO)мышей 25,26, потому что, как и другие млекопитающие, мыши также экспрессируют α-Gal на белках и липидах и не продуцируют IgE к α-Gal. Тем не менее, рыбка данио-рерио (Danio rerio) является полезной моделью для биомедицинских исследований, применяемых к млекопитающим, потому что она имеет много анатомических сходств с млекопитающими и, как и люди, также не может синтезировать α-Gal. Поскольку α-Gal не вырабатывается естественным образом у рыбок данио, это доступная модель, которой легко манипулировать, и она позволяет использовать большой размер выборки для изучения аллергических реакций, связанных с α-Gal.
В этом исследовании рыбки данио-рерио используются в качестве модельного организма для характеристики и описания местных аллергических реакций, поведенческих паттернов и молекулярных механизмов, связанных с реакцией на чрескожную сенсибилизацию к слюне клещей26,27 и последующее потребление мяса млекопитающими. С этой целью рыб подвергают воздействию клещевой слюны путем внутрикожной инъекции, а затем кормят кормом для собак, который содержит продукты мясного происхождения млекопитающих, пригодные для использования животными, которые содержат α-Gal27, затем оцениваются возможные связанные с этим аллергические реакции. Этот метод может быть применен для изучения других биомолекул, связанных с аллергическими процессами, особенно связанных с АГС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Университета Кастилии-Ла-Манча в рамках исследования «Оценка иммунного ответа на инактивированную вакцину M. bovis и вызов M. marinum у рыбок данио-рерио номер модели PR-2017-05-12».
Клещи были получены из лабораторной колонии, где репрезентативные образцы клещей в колонии были проверены методом ПЦР на распространенные клещевые патогены, чтобы подтвердить отсутствие патогенов, и поддерживались в Институте паразитологии Биологического центра Чешской академии наук (IP BC CAS), Чешская Республика.Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Законом о защите животных Чешской Республики No 246/1992 Sb (утверждение этики No 34/2018).
1. Лечение рыбок данио-рерио
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследование предназначено для оценки аллергических реакций и иммунного ответа у рыбок данио, получавших слюну клещей в ответ на потребление мяса млекопитающих.
- Обработайте рыбу (как описано в разделе 4) слюной клеща, коммерческим Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (см. Таблицу материалов), используемым в качестве положительного контроля, с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) в качестве отрицательного контроля. Взрослые рыбки данио-рерио случайным образом распределены на три гендерно-сбалансированные группы (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Любое другое желаемое соединение, связанное с AGS, может быть оценено с использованием этой модели.
2. Экстракция слюны клеща Ixodes ricinus
- Используйте полунабухших самок клещей, которых кормили в течение 6-7 дней на морских свинках.
- Обработайте клеща 5 мкл 2% (мас./об.) раствора гидрохлорида пилокарпина в PBS (см. Таблицу материалов) при рН 7,4 в гемоцель с помощью шприца 50 мкл с иглой 0,33 мм, как было описаноранее 28 , чтобы вызвать выработку слюны клеща.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клещи обрабатываются с помощью щипцов; Будьте осторожны, чтобы не приложить слишком много силы при захвате их. - Соберите слюну с помощью наконечника объемом 10 мкл, установленного на микропипетке.
- Осторожно вводите наконечник внутрь гипостомы клеща.
- Храните слюну в пробирке объемом 1,5 мл на льду, соберите ее и храните при -80 ° C, как описано ранее27.
- Определите концентрацию белка в слюне, чтобы установить количество белка, которое будет введено рыбе, как и в предыдущих исследованиях27 , используя набор для анализа белка BCA (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителя.
3. Содержание рыбок данио-рерио
- Содержание рыбок данио-рерио в проточной системе водоснабжения при температуре 27 °C с циклом светлый/темный 14 ч/10 ч (рис. 2).
- Кормите рыбу два раза в день в 9:30 и 13:30 сухим кормом для рыб (50-70 мкг / рыба) до 2-го дня.
- Кормите рыб два раза в день в 9:30 и 13:30 сухим кормом для собак (50-70 мкг/рыба) со 2-го дня после лечебной инъекции до конца эксперимента
4. Инъекция рыбок данио-рерио
- Выберите 10 рыб в группе с одинаковым соотношением самок/самцов и одинаковым весом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Группа 1 содержит рыбу, которой вводят PBS, группа 2 содержит рыбу, которой вводят слюну клеща, а группа 3 содержит рыбу, которой вводят α-Gal. - Ненадолго обезболите рыбу, погрузив ее в 0,02% метансульфонат трикаина (MS-222) (Фильм 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно анестезированные рыбы демонстрируют нормальное дыхание и не плавают, в то время как их можно поместить на дно резервуара с водой или плавать. Каждая рыба должна быть индивидуально анестезирована, чтобы избежать возможных физиологических повреждений. - Поймайте анестезированную рыбу с помощью рыболовной сети.
- Осторожно положите рыбу на половину с помощью щипцов или рук на влажную губку с хвостовым плавником с правой стороны, чтобы вводить соединения в том же направлении, чтобы контролировать поражения.
- Вводят группы рыб внутрикожно, как и в предыдущих исследованиях26, в мышцу на расстоянии 5 мм от хвостового плавника и под углом 45° по отношению к телу рыбы (фильм 2). Используйте соответствующее лечение в дни 0, 3 и 8, как описано ранее 27, с помощью шприца объемом 100 мкл, оснащенного иглой 1 см, 29 г с 1 мкл (с 9 мкг/мкл белка) слюны I. ricinus в 10 мкл PBS (слюны клеща), 5 мкг α-Gal в 10 мкл PBS (α-Gal)27, и 10 мкл PBS (рис. 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращение должно выполняться быстро и осторожно, чтобы избежать физического повреждения животного.
Другие биомолекулы в слюне клеща могут быть оценены в соответствии с этим протоколом. - Поместите обработанную рыбу обратно в пресноводный резервуар без анестезии для выздоровления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все рыбы одной группы могут быть помещены в один и тот же резервуар с водой для восстановления.
5. Кормление рыбок данио-рерио
- Разомните собачий корм ступкой и пестиком.
- Кормите 50-70 мкг / рыбу два раза в день в 9:30 и 13:30 сухим кормом для рыб до 2-го дня.
- Кормите 50-70 мкг / рыбу два раза в день в 9:30 и 13:30 пюре для собак со 2-го дня после лечебной инъекции до конца эксперимента на 8-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо оценить маркеры иммунитета или титры антител к α-Gal или антителам IgE в ответ на лечение или корм во время различных инокуляций, кормление будет необходимо до конца эксперимента.
6. Оценка аллергических реакций, поражений и поведения рыбок данио.
- Исследуйте геморрагический тип аллергических реакций (покраснение кожи, обесцвечивание и кровоизлияние) с помощью лупы или стереомикроскопа для точности и укажите место их появления на рыбе в соответствии с категоризацией, включенной в таблицу 1 (рис. 4А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Аллергические реакции, представленные на рисунке 4 , появились после инъекции слюны клеща и употребления корма, содержащего красное мясо. Следовательно, описанные реакции относятся к типу реакций, связанных с АГС, поскольку аналогичные реакции появляются в клиническом контексте.- Наблюдайте, появляется ли какая-либо реакция после обработки и при введении корма два раза в день, пока рыба находится в резервуаре с водой.
- Изучите поведение рыб, оценив изменения27 в моделях плавания (подвижность, скорость, неподвижное стояние на дне резервуара с водой и зигзагообразное плавание) в соответствии с категоризацией, включенной в таблицу 1.
- Оцените накопленную смертность, сообщив количество мертвой рыбы, включая время/день смерти (рис. 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все параметры оцениваются сразу после обработки или после смены корма и соблюдаются ежедневно до конца эксперимента на 8-й день, классифицируя качественные переменные (таблица 1). В качестве рекомендации эта оценка должна проводиться профессионалом, обладающим знаниями о рыбках данио, чтобы рассмотреть поведенческие изменения, основанные на их происхождении и опыте работы с этой моделью животных. - Рассчитайте количество рыбок данио-рерио в день с зарегистрированными аллергическими реакциями, ненормальным поведением и изменениями в кормлении в каждой группе и сравните между группами с помощью одностороннего теста ANOVA.
7. Сбор образцов
- Усыпить рыбу погружением в 0,04% MS-222 на 8-й день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также соберите образцы у рыб, которые умирают от аллергических реакций во время испытания. - Закрепите рыбу на парафиновой пластине булавками.
- Соберите сыворотку из жаберных кровеносных сосудов 29 рыб сразу после эвтаназии, когда жабры все еще орошаются кровью, используя шприц объемом 0,5 мл, оснащенный иглой 1 см,29 г. Храните его в пробирке объемом 1,5 мл при температуре -20 °C до использования (видеоролик 3).
- Разрежьте рыбу сагиттально лезвием скальпеля и оцените внутренние поражения (геморрагические поражения или гранулемы)27,30, если они появились.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поражения не обязательно появляются, но должны быть зарегистрированы, если они появляются. - Соберите кишечник (Фильм 4) и почки (Фильм 5) у каждой рыбы в отдельные пустые пробирки объемом 1,5 мл, как описаноранее 31, и храните их при температуре -80 ° C (рис. 4C).
- Извлеките общую РНК из образцов кишечника и почек рыбок данио-рерио с помощью набора для очистки РНК (см. Таблицу материалов).
- Проанализируйте экспрессию генов, связанных с иммунным ответом, как описано ранее30,32 (см. Таблицу 2 для последовательностей праймера) у рыбок данио, выполняя количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) с использованием смеси обратной транскрипции для ОТ-кПЦР (см. Таблицу материалов), в соответствии с инструкциями производителя. Нормализуйте значения мРНК cT по сравнению с D. rerio GAPDH и сравните группы (рыбы, обработанные слюной, α-Gal, и группы, обработанные PBS), используя t-критерий Стьюдента с неравной дисперсией.
- Определите титры антител IgM, которые распознают α-Gal у рыбок данио, в образцах сыворотки с помощью ИФА, как описано ранее27,30. Запишите титры антител в виде значений O.D.450 нм с помощью считывателя планшетов и сравните группы (рыбы, обработанные слюной, α-Gal, и группы, обработанные PBS), используя t-критерий Стьюдента с неравной дисперсией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение титров антител IgM и анализ экспрессии генов не являются обязательными и проводятся только в том случае, если требуется иммунологическая информация. Смесь ОТ-кПЦР представляет собой набор для синтеза первой цепи кДНК для анализа экспрессии генов с использованием кПЦР в реальном времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представленный здесь протокол основан на нескольких аспектах ранее опубликованных экспериментов27,30 и результатах, выполненных в нашей лаборатории, где модель рыбок данио-рерио установлена и проверена для изучения AGS и иммунного ответа на α-Gal, поскольку и люди, и рыбки данио-рерио не синтезируют эту молекулу13. Эта модель позволяет охарактеризовать и оценить различные аллергические реакции в результате реакции хозяина на слюну клеща (рис. 4) и их влияние на АГС. Кроме того, изменения в поведении, такие как медленное плавание (Фильм 6), лежание на дне аквариума (Фильм 7) и отказ от еды, вибрация или зигзагообразные движения (Фильм 8), наблюдаются у рыб в ответ на обработку слюной клеща, которая не наблюдается у контрольной рыбы; Эти результаты особенно важны после введения корма для собак на 2-й день. К этому моменту рыба уже была сенсибилизирована альфа-галом и слюной клеща, и началось введение красного мяса через корм. Наконец, значительная частота аллергических реакций наблюдается у рыб, обработанных слюной клещей (рис. 4A, B и таблица 3), только у рыбок данио, подвергшихся воздействию слюны клеща, развились аллергические реакции, демонстрирующие быструю десенсибилизацию и толерантность. С другой стороны, в предыдущих исследованиях у рыбок данио, которых кормили кормом для рыб, не развивалось каких-либо видимых повреждений или реакций27. Поведенческие изменения были более выражены у рыб, получавших слюну клещей, чем только α-галлон (рис. 5). Дополнительный анализ экспрессии наиболее репрезентативных производителей иммунного ответа (ИФН, TLR 2, IL1 β и AKR2) был проведен с помощью ОТ-ПЦР (таблица 3) с целью изучения различных иммунных ответов на лечение. Результаты показали различия между группами рыбок данио-рерио в почках, где большинство маркеров иммунного ответа, по-видимому, были подавлены у рыб, получавших слюну и α-Gal, по сравнению с контрольной группой (рис. 6), но существенных различий в экспрессии генов в кишечнике обнаружено не было. Предыдущие исследования аллергических реакций на различные компоненты слюны клещей у рыбок данио-рерио показали аналогичные результаты27. Кроме того, в качестве репрезентативных результатов у рыбок данио, получавших слюну клещей и α-Gal с использованием этого протокола, выработались антитела IgM против α-Gal, которые показали более высокие уровни, чем у рыб, получавших PBS (рис. 7), как было обнаружено в предыдущих исследованиях27,30.
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн для испытания рыбок данио. Рыбам внутрикожно вводят α-Gal, слюну клещей и PBS в качестве отрицательного контроля. Образцы собирают после того, как рыба умирает или в конце эксперимента. Образцы могут быть использованы для анализа уровней анти-α-Gal IgM и экспрессии выбранных генных маркеров иммунного ответа с помощью qRT-PCR27. Поведенческие изменения или аллергические реакции регистрируются на протяжении всего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Экспериментальная установка для рыбок данио. Рыбки данио-рерио содержатся в проточной водной системе при температуре 27 °C с циклом светлый/темный 14 ч/10 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Инъекция для лечения рыбок данио. Инъекция рыбок данио-рерио с помощью шприца 100 мкл с иглой 1 см, 29 G проводится внутрикожно на расстоянии 5 мм от хвостового плавника. Рыб обезболивают и обрабатывают одну за другой губкой, смоченной в теплой воде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Признаки геморрагических реакций анафилактического типа у рыбок данио, которым вводили слюну клещей и которые умерли на 2-й день до смены корма. (А) Рыба с аллергическими реакциями в аквариуме после обработки. (B) Рыба, погибшая от геморрагических анафилактических реакций (тип аллергической реакции: обесцвечивание и покраснение кожи. С) Отбор проб. Красные стрелки указывают на кишечник, а красные круги указывают на почку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Поведенческий паттерн, наблюдаемый у рыб. Аномальные модели поведения состояли из медленного плавания, неподвижного стояния на дне резервуара с водой и зигзагообразного плавания. Синими стрелками указано время лечения, а красной стрелкой указано время перехода с корма для рыб на корм для собак. Рыбы, которых кормили собачьим кормом, сравнивали между контрольными рыбами, обработанными слюной, и контрольными рыбами, обработанными PBS, с помощью одностороннего теста ANOVA (p = 0,05; N = 5 рыб на группу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Экспрессия выбранных маркеров иммунного ответа в почках рыбок данио. Анализ экспрессии генов методом qRT-PCR в почках рыбок данио-рерио в конце эксперимента. Значения мРНК cT нормализуются по отношению к D. rerio GAPDH, представленному как среднее ± SD, и сравниваются между рыбами, получавшими слюну, α-Gal, и контрольной группой, получавшей PBS, с помощью t-критерия Стьюдента с неравной дисперсией (*p < 0,05; N = 3-7). Эта цифра была взята из27 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Титры антител IgM. Титры антител IgM рыбок данио-рерио против α-Gal определяются с помощью ИФА, представленного как среднее значение ± SD O.D. при 450 нм и сравнивается между рыбами, получавшими слюну, α-Gal, и контрольной группой, получавшей PBS, с помощью t-критерия Стьюдента с неравной дисперсией (*p < 0,005; N = 3-7). Эта цифра была взята из27 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Оцениваются поражения и модели поведения. Категоризация качественных переменных. Параметры, которые оцениваются качественно, - это травмы (на плавниках и чешуе), плавание, кормление и то, вызвана ли гибель рыбы тестом или обращением. Как субъективное соображение, каждая переменная классифицируется от очень легкой до тяжелой Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Олигонуклеотидные праймеры и температуры отжига для qRT-PCR. Эта таблица была взята из30 и воспроизводится с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Репрезентативные результаты. Записи об аллергии и смерти рыбок данио, а также экспрессия выбранных маркеров иммунного ответа анализируются с помощью qRT-PCR в почках и кишечнике рыбок данио. Значения мРНК cT нормализуют по сравнению с D. rerio GAPDH и сравнивают между рыбами, получавшими слюну, α-Gal, и контрольной группой, получавшей PBS, с помощью t-критерия Стьюдента с неравной дисперсией (*p < 0,05; N = 3-7). Эта таблица была принята из 27,30 и воспроизведена с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Фильм 1: Анестезированная рыба. Анестезированная рыба не проявляет движения и не плавает, но продолжает дышать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2: Инъекция лечения в рыбу. Рыб помещают под наркозом на влажную губку и вводят под углом 45 ° к телу с указанной обработкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 3: Забор сыворотки из жаберных кровеносных сосудов. Рыбу фиксируют на парафиновой пластине с помощью булавок, а сыворотку собирают из жабр с помощью шприца объемом 0,5 мл, оснащенного иглой 1 см, 29 г. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 4: Сбор кишечника от усыпленной рыбы. Рыбу разрезают сагиттально с помощью лезвия скальпеля и собирают кишечник пинцетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 5: Сбор почек от усыпленной рыбы. Плавательный пузырь удаляется, а почка собирается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 6: Репрезентативные аспекты поведения, наблюдаемые у обработанных рыбок данио. Одна рыба показала медленное плавание. Все рыбы из одной группы находятся в одном аквариуме, Видео является примером, иллюстрирующим это поведение, и несколько рыб могут иметь такое поведение в разное время дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 7: Репрезентативные аспекты поведения, наблюдаемые у обработанных рыбок данио. Одна рыба осталась на дне аквариума. Все рыбы из одной группы находятся в одном аквариуме, Видео является примером, иллюстрирующим это поведение, и несколько рыб могут иметь такое поведение в разное время дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 8: Репрезентативные аспекты поведения, наблюдаемые у обработанных рыбок данио. Одна рыба показала вибрирующее плавание. Все рыбы из одной группы находятся в одном аквариуме, Видео является примером, иллюстрирующим это поведение, и несколько рыб могут иметь такое поведение в разное время дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рыбки данио-рерио - это экономичная и простая в обращении модель, которая также является очень эффективным инструментом для изучения молекулярных механизмов иммунного ответа, патогенных заболеваний, тестирования новых лекарств, а также вакцинации и защиты от инфекций33,34,35. Исследование поведения рыбок данио-рерио полезно, поскольку предыдущие исследования показали, что некоторые виды рыб остаются неподвижными на дне аквариума, когда они испытывают стресс, что влияет на их потребление пищи, они едят меньше; Кроме того, зигзагообразное движение при движении также может быть связано со стрессом и беспокойством рыб36,37. Информация, полученная в результате исследований путем оценки этих параметров у рыбок данио, обеспечит фундаментальное понимание молекулярных взаимодействий клеща и хозяина и механизмов, участвующих в иммунном ответе хозяина на α-Gal, который может привести к развитию АГС, включая аллергию на потребление мяса млекопитающих.
Чтобы избежать ложноположительных реакций на введенную молекулу, важно выполнить внутрикожную инъекцию не очень глубоко, параллельно телу рыбки данио, и оценить, не повреждена ли рыба во время инъекции. Рыба с травмой, полученной в результате обращения или проникновения иглы, не должна быть включена в анализ. Кроме того, настоятельно рекомендуется, чтобы специалист, обладающий знаниями о рыбках данио, оценивал изменения в поведении, такие как плавание и кормление, чтобы рассмотреть поведенческие изменения на основе их происхождения и опыта работы с этой моделью38. Еще одним важным соображением является анестезия; Адекватная доза важна для оптимального состояния собранных образцов. Кроме того, во время инъекционного лечения избегается более выраженная реакция на стресс, что может компенсировать возможные трудности, связанные с диагностикой стресса29.
Результаты показали, что модель рыбок данио-рерио также может расширить возможности оценки рисков развития АГС после укуса клеща и других аллергических реакций. Кроме того, цели для диагностики, лечения и профилактики этих аллергий могут быть применены к людям, поскольку этот метод и параметры, которые оцениваются, позволяют более точно охарактеризовать аллергические реакции у рыбок данио.
Этот метод может позволить оценить другие биогенные молекулы слюны, ответственные за аллергические реакции и присутствующие в слюне клеща. Содержание α-Gal в слюне клещей ранее было количественно определено27, но неизвестно, какие еще соединения могут участвовать в развитии АГС. Аллергические реакции наблюдались в группах, получавших слюну клеща и α-Gal, но не в группах PBS (таблица 3), однако поведение больше пострадало в группе, обработанной слюной клеща, чем в группе α-Gal (рис. 5). Исходя из этих данных, наша гипотеза будет заключаться в том, что другие биомолекулы в сочетании с альфа-Gal участвуют в AGS, поэтому дальнейшие эксперименты должны изучить, какие другие молекулы, присутствующие в слюне, влияют на эти результаты. Кроме того, титры антител к альфа-галу были значительно выше у рыбок данио, получавших слюну клещей и альфа-гал, которые, как и в предыдущих исследованиях26,29, показали иммунный ответ на альфа-гал, присутствующий в слюне клеща (рис. 7).
Наконец, маркеры иммунного ответа оказались подавленными в группах рыбок данио, получавших слюну клещей и альфа-гал, по сравнению с группой, получавшей PBS (таблица 3 и рисунок 6). Эти результаты согласуются с результатами, полученными в других исследованиях, где были протестированы другие биомолекулы, связанные с AGS27, но в отличие от предыдущих исследований25 , где мыши α-Gal KO в ответ на укусы клещей и потребление красного мяса показали ответ IgE и повышенную экспрессию воспалительных сигнальных путей Toll-подобного рецептора (TLR) и IL-1, что привело к активации Akr2. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять пути активации этих реакций на слюну клещей и другие биомолекулы у рыбок данио, которые могут быть достигнуты путем применения этой методологии.
Затем эта методология может позволить проводить скрининг биомолекул, которые по отдельности или в комбинации вызывают аллергические реакции и которые могут влиять на иммунный ответ хозяина, приводящий к аллергическим заболеваниям, таким как АГС и другие клещевые аллергии27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов группы SaBio за их сотрудничество в разработке эксперимента и техническую помощь с экспериментальной установкой для рыбы, а также Хуана Гальсерана Саеса (IN-CSIC-UMH, Испания) за предоставление рыбок данио. Эта работа была поддержана Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Испания и EU-FEDER (грант BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Маринела Контрерас финансируется Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Испания, грант IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
