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Immunology and Infection

टिक सलाइवा बायोमोलेक्यूल्स के जवाब में एलर्जी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए ज़ेबराफिश पशु मॉडल

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64378
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1SaBio. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos IREC (CSIC-UCLM-JCCM), 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Oklahoma State University

Summary

यहां, ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) का उपयोग टिक लार और स्तनधारी मांस की खपत के लिए एलर्जी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करके अल्फा-गैल सिंड्रोम (एजीएस) से संबंधित एलर्जी प्रतिक्रियाओं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है।

Abstract

टिक आर्थ्रोपोड वैक्टर हैं जो रोगज़नक़ संचरण द्वारा बीमारी का कारण बनते हैं और जिनके काटने से दुनिया भर में मानव स्वास्थ्य को प्रभावित करने वाली एलर्जी प्रतिक्रियाओं से संबंधित हो सकता है। कुछ व्यक्तियों में, ग्लाइकन गैल1-3 गैल1-(3)4जीएलसीएनएसी-आर (α-गैल) के खिलाफ इम्युनोग्लोबुलिन ई एंटीबॉडी के उच्च स्तर टिक काटने से प्रेरित हुए हैं। टिक लार में मौजूद ग्लाइकन α-गैल युक्त ग्लाइकोप्रोटीन और ग्लाइकोलिपिड्स द्वारा मध्यस्थ एनाफिलेक्टिक प्रतिक्रियाएं अल्फा-गैल सिंड्रोम (एजीएस) या स्तनधारी मांस एलर्जी से संबंधित हैं। जेब्राफिश (डेनियो रेरियो) विभिन्न विकृतियों के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला कशेरुक मॉडल बन गया है। इस अध्ययन में, जेब्राफिश का उपयोग α-गैल और स्तनधारी मांस की खपत के जवाब में एलर्जी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया था क्योंकि, मनुष्यों की तरह, वे इस ग्लाइकन को संश्लेषित नहीं करते हैं। इस उद्देश्य के लिए, इक्सोड्स रिसिनस टिक लार और स्तनधारी मांस की खपत के जवाब में व्यवहार पैटर्न और रक्तस्रावी एनाफिलेक्टिक-प्रकार एलर्जी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया था। यह प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एजीएस सहित टिक-जनित एलर्जी के अध्ययन के लिए ज़ेबराफिश पशु मॉडल का समर्थन करने वाले वैध डेटा के अवलोकन की अनुमति देता है।

Introduction

टिक्स रोगजनकों के वैक्टर हैं जो बीमारियों का कारण बनते हैं और एलर्जी प्रतिक्रियाओं का कारण भी होते हैं, जो दुनिया भर में मनुष्यों और जानवरों के स्वास्थ्य को प्रभावित करते हैं। टिक फीडिंग के दौरान, टिक लार में बायोमोलेक्यूल्स, विशेष रूप से प्रोटीन और लिपिड, इन एक्टोपारासाइट्स को खिलाने की सुविधा प्रदान करते हैं, मेजबान सुरक्षा सेबचते हैं। ग्लाइकन गैल1-3 गैल1-(3)4जीएलसीएनएसी-आर (α-गैल) संशोधनों के साथ कुछ लार बायोमोलेक्यूल्स केवल कुछ व्यक्तियों में टिक काटने के बाद उच्च एंटी-α-गैल आईजीई एंटीबॉडी स्तर का उत्पादन करते हैं, जिसे α-गैल सिंड्रोम (एजीएस) 4 के रूप में जाना जाता है। यह आईजीई-मध्यस्थता एलर्जी से जुड़ी एक बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप एनाफिलेक्सिस में टिक काटने, गैर-प्राइमेट स्तनधारी मांस की खपत और कुछ दवाएं जैसे कि सेतुक्सिमाब5 हो सकती हैं। α-गैल की प्रतिक्रियाएं अक्सर गंभीर होती हैं और कभी-कभी घातक हो सकती हैं 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

α-गैल पुरानी दुनिया के बंदरों, वानरों और मनुष्यों को छोड़कर सभी स्तनधारियों में पाया जाता है जिनके पास α-गैल13 को संश्लेषित करने की क्षमता नहीं है। हालांकि, बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ जैसे रोगजनक इस ग्लाइकन को अपनी सतह पर व्यक्त करते हैं, जो एंटी-α-गैल आईजीएम / आईजीजी एंटीबॉडी की उच्च मात्रा के उत्पादन को प्रेरित कर सकता है और इन रोगजनकोंके खिलाफ एक सुरक्षात्मक तंत्र हो सकता है। हालांकि, एंटी-α-गैल एंटीबॉडी के उत्पादन से आईजीई-मध्यस्थता एंटी-α-गैल एलर्जी 7,13 विकसित होने का खतरा बढ़ जाता है। मनुष्यों में उत्पादित प्राकृतिक एंटी-α-गैल एंटीबॉडी, मुख्य रूप से आईजीएम / आईजीजी उपप्रकारों के, आंत माइक्रोबायोटा16 से बैक्टीरिया में मौजूद इस संशोधन से जुड़े हो सकते हैं। एजीएस एक चुनौतीपूर्ण नैदानिक निदान हो सकता है, क्योंकि इस समय मुख्य नैदानिक विधि विलंबित एलर्जी प्रतिक्रियाओं के नैदानिक इतिहास पर आधारित है, विशेष रूप से खाद्य एलर्जी (यानी, प्रुरिटस, स्थानीय पित्ती, या एनाफिलेक्सिस, पित्ती और जठरांत्र संबंधी लक्षणों के लिए आवर्तक एंजियोएडेमा) और आईजीई एंटी-α-गैल एंटीबॉडी स्तर9 का माप। वर्तमान निष्कर्ष बताते हैं कि टिक काटने एजीएस18,19 की उपस्थिति में प्रमुख जोखिमों में से एक है, टिक बाइट 19 के बाद आईजीई के स्तर में 20 गुना या अधिक वृद्धि α-गैल, एजीएस20,21,22 के रोगियों में टिक काटने का इतिहास, एजीएस रोगियों में टिक एंटीजन के लिए प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी का अस्तित्व। और यह कि एंटी-α-गैल आईजीई एंटी-टिक आईजीई स्तर19,23 से दृढ़ता से संबंधित हैं, लेकिन यह आकलन करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है कि वास्तव में कौन से बायोमोलेक्यूल्स शामिल हैं।

इसके अलावा, एक और संभावित परिदृश्य ऐसे रोगी हैं जो टिक काटने और एंटी-α-गैल आईजीई एंटीबॉडी के उच्च स्तर के लिए मजबूत एलर्जी प्रतिक्रियाएं पेश करते हैं लेकिन स्तनधारी मांस की खपतके लिए सहिष्णु हैं। इसलिए, स्तनधारी मांस एलर्जी एक विशेष प्रकार की टिक काटने से संबंधित एलर्जी हो सकती है। एजीएस से जुड़ी प्रमुख टिक प्रजातियों में एंबलियोम्मा अमेरिकनम (यूएसए), एंबलियोम्मा मूर्तिकला (ब्राजील), एंबलियोम्मा टेस्टुडिनेरियम और हेमाफिसेलिस लॉन्गिकोर्निस (जापान), इक्सोड्स होलोसिकलस (ऑस्ट्रेलिया), और इक्सोड्स रिसिनस (यूरोप में लाइम बोरेलियोसिस का मुख्य वेक्टर) 11,24 शामिल हैं।

टिक काटने से संबंधित आईजीई उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एकमात्र मॉडल माउस मॉडल है जो आनुवंशिक रूप से α-1,3-गैलेक्टोसिलट्रांसफेरेज़ नॉक आउट (α-गैल केओ) चूहोंके लिए जीन के साथ संशोधित है क्योंकि अन्य स्तनधारियों की तरह, चूहे भी प्रोटीन और लिपिड पर α-गैल व्यक्त करते हैं और आईजीई से α-गैल का उत्पादन नहीं करते हैं। हालांकि, ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) स्तनधारियों पर लागू बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए एक उपयोगी मॉडल है क्योंकि यह स्तनधारियों के साथ कई शारीरिक समानताएं साझा करता है और, मनुष्यों की तरह, α-गैल को संश्लेषित करने में भी असमर्थ है। चूंकि α-गैल ज़ेब्राफिश में स्वाभाविक रूप से उत्पादित नहीं होता है, इसलिए यह एक किफायती मॉडल है, हेरफेर करना आसान है, और α-गैल से संबंधित एलर्जी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उच्च नमूना आकार की अनुमति देता है।

इस अध्ययन में, ज़ेबराफिश का उपयोग स्थानीय एलर्जी प्रतिक्रियाओं, व्यवहार पैटर्न और टिक लार26,27 और बाद में स्तनधारी मांस की खपत के लिए परक्यूटेनियस संवेदीकरण की प्रतिक्रिया से जुड़े आणविक तंत्र को चिह्नित करने और वर्णन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में किया जाता है। इस उद्देश्य के लिए, मछली को इंट्राडर्मल इंजेक्शन द्वारा टिक लार के संपर्क में लाया जाता है और फिर कुत्ते के फ़ीड के साथ खिलाया जाता है, जिसमें जानवरों के उपयोग के लिए उपयुक्त स्तनधारी मांस-व्युत्पन्न उत्पाद होते हैं जिनमें α-गैल27 होता है, फिर संभावित संबंधित एलर्जी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया जाता है। इस विधि को एलर्जी प्रक्रियाओं से संबंधित अन्य बायोमोलेक्यूल्स के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से एजीएस से संबंधित।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को कैस्टिला ला मंच विश्वविद्यालय की पशु प्रयोग पर आचार समिति द्वारा "जेब्राफिश मॉडल नंबर पीआर-2017-05-12 में निष्क्रिय एम बोविस वैक्सीन के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एम मारिनम के साथ चुनौती का मूल्यांकन" अध्ययन के तहत अनुमोदित किया गया है।

टिक्स प्रयोगशाला कॉलोनी से प्राप्त किए गए थे, जहां कॉलोनी में टिक्स के प्रतिनिधि नमूनों को पीसीआर द्वारा रोगजनकों की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए सामान्य टिक रोगजनकों के लिए परीक्षण किया गया था, और चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज (आईपी बीसी सीएएस), चेक गणराज्य के इंस्टीट्यूट ऑफ पैरासिटोलॉजी, बायोलॉजी सेंटर में बनाए रखा गया था।

1. जेब्राफिश उपचार

नोट: परीक्षण स्तनधारी मांस की खपत के जवाब में टिक लार के साथ इलाज किए गए ज़ेब्राफिश में एलर्जी प्रतिक्रियाओं और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

  1. मछली (जैसा कि खंड 4 में समझाया गया है) को टिक लार, वाणिज्यिक गैला 1-3गल-बीएसए 3 (α-गैल) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ इलाज करें, जिसका उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है, जिसमें फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में होता है। वयस्क ज़ेबराफिश को यादृच्छिक रूप से तीन लिंग-संतुलित समूहों में वितरित किया जाता है (चित्रा 1)।
    नोट: एजीएस से संबंधित किसी भी अन्य वांछित यौगिक का मूल्यांकन इस मॉडल का उपयोग करके किया जा सकता है।

2. इक्सोड्स रिकिनस टिक लार निष्कर्षण

  1. गिनी सूअरों पर 6-7 दिनों के लिए खिलाए गए अर्ध-संक्रमित रोगज़नक़-मुक्त मादा टिक्स का उपयोग करें।
  2. पीबीएस में पाइलोकार्पिन हाइड्रोक्लोराइड के 2% (डब्ल्यूटी /वॉल्यूम) घोल के 5 μL के साथ टिक का इलाज करें ( सामग्री की तालिका देखें) पीएच 7.4 पर हेमोकोल में 0.33 मिमी सुई के साथ 50 μL सिरिंज का उपयोग करें जैसा कि पहले28 में बताया गया था।
    नोट: टिक्स को फोर्सप्स का उपयोग करके संभाला जाता है; उन्हें पकड़ते समय बहुत अधिक ताकत लागू न करने के लिए सतर्क रहें।
  3. एक माइक्रोपिपेट पर लगाए गए 10 μL टिप का उपयोग करके लार इकट्ठा करें।
    1. टिक हाइपोस्टोम के अंदर टिप को सावधानी से पेश करें।
    2. लार को बर्फ पर 1.5 एमएल ट्यूब में रखें, इसे पूल करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जैसा कि पहले वर्णित27 है।
  4. लार प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करें, ताकि निर्माता की सिफारिशों के बाद बीसीए प्रोटीन परख किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके पिछलेअध्ययनों की तरह मछली में इंजेक्ट किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा स्थापित की जा सके।

3. जेब्राफिश का रखरखाव

  1. 14 घंटे /10 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह-माध्यम जल प्रणाली में ज़ेबराफिश बनाए रखें (चित्र 2)।
  2. मछली को दिन 2 बजे तक सूखी मछली फ़ीड (50-70 μg / fish) के साथ दिन 9:30 बजे और 1:30 बजे खिलाएं।
  3. उपचार इंजेक्शन के बाद दूसरे दिन से प्रयोग के अंत तक सूखे कुत्ते के फ़ीड (50-70 μg / fish) के साथ मछली को दो बार दैनिक 9:30 बजे और 1:30 बजे खिलाएं

4. जेब्राफिश इंजेक्शन

  1. मादाओं/पुरुषों के समान अनुपात और समान वजन के साथ प्रति समूह 10 मछलियों का चयन करें।
    नोट: समूह 1 में पीबीएस के साथ इंजेक्ट की गई मछली होती है, समूह 2 में टिक लार के साथ इंजेक्ट की गई मछली होती है, और समूह 3 में α-गैल के साथ इंजेक्ट की गई मछली होती है।
  2. 0.02% ट्राइकेन मीथेनसुल्फोनेट (एमएस -222) (मूवी 1) में विसर्जन करके मछली को संक्षेप में एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: ठीक से एनेस्थेटाइज्ड मछली सामान्य श्वास दिखाती है और कोई तैराकी नहीं दिखाती है, जबकि उन्हें पानी की टंकी के तल पर रखा जा सकता है या तैर रहा है। संभावित शारीरिक क्षति से बचने के लिए प्रत्येक मछली को व्यक्तिगत रूप से एनेस्थेटाइज्ड किया जाना चाहिए।
  3. मछली पकड़ने के जाल का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड मछली को पकड़ें।
  4. घावों को नियंत्रित करने के लिए यौगिकों को एक ही दिशा में इंजेक्ट करने के लिए मछली को अपनी आधी तरफ, एक गीले स्पंज पर सावधानीपूर्वक, दाहिनी ओर पुच्छल पंख के साथ रखें।
  5. मछली के समूहों को इंट्राडर्मल रूप से इंजेक्ट करें, जैसा कि पिछलेअध्ययनों 26 में, मांसपेशियों में पुच्छल पंख के लिए 5 मिमी और मछली के शरीर के संबंध में 45 डिग्री कोण पर (मूवी 2)। 0, 3, और 8 दिनों में उपयुक्त उपचार का उपयोग करें जैसा कि पहले वर्णित किया गया था,100 μL सिरिंज के साथ 100 μL सिरिंज के साथ, 1 μL के साथ 29 G सुई के साथ I. ricinus लार 10 μL PBS (टिक सलाइवा), 5μg α-Gal में 10 μL PBS (α-Gal)27,  और पीबीएस के 10 μL (चित्रा 3)।
    नोट: जानवर को किसी भी शारीरिक नुकसान से बचने के लिए हैंडलिंग जल्दी और सावधानी से की जानी चाहिए।
    टिक लार में अन्य बायोमोलेक्यूल्स का मूल्यांकन इस प्रोटोकॉल का पालन करके किया जा सकता है।
  6. इलाज की गई मछली को पुनर्प्राप्ति के लिए संज्ञाहरण के बिना मीठे पानी के टैंक में वापस रखें।
    नोट: एक ही समूह की सभी मछलियों को पुनर्प्राप्ति के लिए एक ही पानी की टंकी में रखा जा सकता है।

5. जेब्राफिश खिलाना

  1. कुत्ते के भोजन को मोर्टार और मूसल के साथ मैश करें।
  2. 50-70 μg / मछली को दिन 2 तक सूखी मछली के फ़ीड के साथ दिन 9:30 बजे और दोपहर 1:30 बजे दो बार खिलाएं।
  3. उपचार इंजेक्शन के बाद दूसरे दिन से 8 वें दिन प्रयोग के अंत तक मैश किए हुए कुत्ते के फ़ीड के साथ 50-70 μg / मछली को दिन में दो बार सुबह 9:30 बजे और 1:30 बजे खिलाएं।
    नोट: यदि विभिन्न टीकाकरण के दौरान उपचार या फ़ीड के जवाब में α-गैल या आईजीई एंटीबॉडी के लिए प्रतिरक्षा मार्कर या एंटीबॉडी टिटर्स का मूल्यांकन किया जाना है, तो प्रयोग के अंत तक भोजन आवश्यक होगा।

6. ज़ेबराफिश में एलर्जी प्रतिक्रियाओं, घावों और व्यवहार का मूल्यांकन

  1. सटीकता के लिए मैग्निफायर या स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके रक्तस्रावी प्रकार की एलर्जी प्रतिक्रियाओं (त्वचा की लालिमा, मलिनकिरण और रक्तस्राव) की जांच करें और तालिका 1 (चित्रा 4 ए) में शामिल वर्गीकरण के बाद मछली पर उनकी उपस्थिति के स्थान को इंगित करें।
    नोट: चित्रा 4 में प्रस्तुत एलर्जी प्रतिक्रियाएं टिक लार के इंजेक्शन और लाल मांस युक्त फ़ीड की खपत के बाद दिखाई दीं। इसलिए, वर्णित प्रतिक्रियाएं एजीएस से जुड़ी प्रतिक्रियाओं के प्रकार हैं, क्योंकि नैदानिक संदर्भ में समान प्रतिक्रियाएं दिखाई देती हैं।
    1. निरीक्षण करें कि क्या उपचार के बाद और दिन में दो बार भोजन का प्रशासन करते समय कोई प्रतिक्रिया दिखाई देती है, जबकि मछली पानी की टंकी में होती है।
  2. तालिका 1 में शामिल वर्गीकरण के बाद तैराकी पैटर्न (गतिशीलता, गति, पानी की टंकी के तल पर गतिहीन खड़े होना, और ज़िगज़ैग तैराकी) में परिवर्तन27 का मूल्यांकन करके मछली के व्यवहार की जांच करें।
  3. संचित मृत्यु दर का मूल्यांकन करें, मृत्यु के समय / दिन सहित मृत मछलियों की संख्या की रिपोर्ट करें (चित्रा 4 बी)।
    नोट: सभी मापदंडों का मूल्यांकन उपचार के ठीक बाद या फ़ीड के परिवर्तन के बाद किया जाता है और गुणात्मक चर को वर्गीकृत करने वाले दिन 8 पर प्रयोग के अंत तक दैनिक रूप से पालन किया जाता है (तालिका 1)। एक सिफारिश के रूप में, यह मूल्यांकन ज़ेबराफिश पर ज्ञान वाले एक पेशेवर द्वारा आयोजित किया जाना चाहिए ताकि उनकी पृष्ठभूमि और इस पशु मॉडल के साथ काम करने के अनुभव के आधार पर व्यवहार परिवर्तनों पर विचार किया जा सके।
  4. प्रत्येक समूह में एलर्जी प्रतिक्रियाओं, असामान्य व्यवहार और भोजन परिवर्तनों के साथ प्रति दिन ज़ेबराफिश की संख्या की गणना करें और एक तरफ़ा एनोवा परीक्षण द्वारा समूहों के बीच तुलना करें।

7. नमूना संग्रह

  1. दिन 8 पर 0.04% एमएस -222 में विसर्जन द्वारा मछली को इच्छामृत्यु करें।
    नोट: परीक्षण के दौरान एलर्जी प्रतिक्रियाओं से मरने वाली मछलियों से नमूने भी एकत्र करें।
  2. मछली को पिन के साथ एक पैराफिन प्लेट पर ठीक करें।
  3. इच्छामृत्यु के तुरंत बादमछली के गिल-रक्त वाहिकाओं से सीरम एकत्र करें, जब गलफड़ों को अभी भी रक्त से सिंचित किया जाता है, 1 सेमी, 29 ग्राम सुई के साथ फिट 0.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके। उपयोग होने तक इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एमएल ट्यूब में स्टोर करें (मूवी 3)।
  4. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ मछली को काटें और आंतरिक घावों (रक्तस्रावी घावों या ग्रैनुलोमा) 27,30 का मूल्यांकन करें यदि वे दिखाई देते हैं।
    नोट: घाव आवश्यक रूप से दिखाई नहीं देते हैं लेकिन यदि वे करते हैं तो उन्हें पंजीकृत किया जाना चाहिए।
  5. प्रत्येक मछली से आंत (मूवी 4) और किडनी (मूवी 5) को अलग-अलग खाली 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें, जैसा कि पहलेवर्णित 31 था, और उन्हें -80 सी (चित्रा 4 सी) पर स्टोर करें।
  6. आरएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके ज़ेब्राफिश आंत और गुर्दे के नमूनों से कुल आरएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, आरटी-क्यूपीसीआर के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मिक्स का उपयोग करके मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) का प्रदर्शन करते हुए, जेब्राफिश में पहले वर्णित 30,32 (प्राइमर अनुक्रमों के लिए तालिका 2 देखें) के रूप में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें। रेरियो जीएपीडीएच के खिलाफ एमआरएनए सीटी मूल्यों को सामान्य करें, और असमान भिन्नता के साथ छात्र टी-टेस्ट का उपयोग करके समूहों (लार, α-गैल और पीबीएस-उपचारित समूहों के साथ इलाज की गई मछली) के बीच तुलना करें।
  8. आईजीएम एंटीबॉडी टिटर्स निर्धारित करें जो एलिसा द्वारा सीरम नमूनों में जेब्राफिश में α-गैल को पहचानते हैं जैसा कि पहले27,30 वर्णित है। प्लेट रीडर का उपयोग करके एंटीबॉडी टिटर्स को ओ.डी.450 एनएम मानों के रूप में रिकॉर्ड करें, और असमान विचरण के साथ छात्र टी-टेस्ट का उपयोग करके समूहों (लार, α-गैल और पीबीएस-उपचारित समूहों के साथ इलाज की गई मछली) के बीच तुलना करें।
    नोट: आईजीएम एंटीबॉडी टिटर्स और अभिव्यक्ति जीन विश्लेषण का निर्धारण वैकल्पिक है और केवल तभी आयोजित किया जाता है जब प्रतिरक्षात्मक जानकारी की आवश्यकता होती है। आरटी-क्यूपीसीआर मिश्रण वास्तविक समय क्यूपीसीआर का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक पहला-स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण किट है।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले प्रकाशितप्रयोगों 27,30 के कई पहलुओं और हमारी प्रयोगशाला में किए गए परिणामों पर आधारित है जहां जेब्राफिश मॉडल स्थापित किया गया है और एजीएस के अध्ययन और α-गैल के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए मान्य है क्योंकि मनुष्य और ज़ेबराफिश दोनों इस अणु13 को संश्लेषित नहीं करते हैं। यह मॉडल टिक लार (चित्रा 4) और एजीएस में उनके निहितार्थ के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रकार की एलर्जी प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन और मूल्यांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, व्यवहार में परिवर्तन जैसे धीमी तैराकी (मूवी 6), टैंक के तल पर लेटना (मूवी 7), और खाना नहीं खाना, कंपन, या ज़िगज़ैगिंग गति (मूवी 8) मछली में टिक लार उपचार के जवाब में देखा जाता है जो नियंत्रण मछली में नहीं देखा जाता है; ये निष्कर्ष विशेष रूप से दिन 2 पर कुत्ते के भोजन के प्रशासन के बाद महत्वपूर्ण हैं। इस बिंदु पर, मछली को पहले से ही अल्फा-गैल और टिक लार के साथ संवेदनशील बनाया गया था, और फ़ीड के माध्यम से लाल मांस का प्रशासन शुरू हुआ। अंत में, टिक लार (चित्रा 4 ए, बी और तालिका 3) के साथ इलाज की गई मछली में एलर्जी प्रतिक्रियाओं की एक महत्वपूर्ण घटना देखी जाती है, केवल ज़ेब्राफिश जो टिक लार के संपर्क में थी, ने एलर्जी प्रतिक्रियाओं को विकसित किया, जो तेजी से डिसेन्सिटाइजेशन और सहिष्णुता दिखाते हैं। दूसरी ओर, पिछले अध्ययनों में, मछली के भोजन के साथ खिलाए गए ज़ेबराफिश ने कोई दृश्यमान घाव या प्रतिक्रिया विकसित नहींकी थी। व्यवहार परिवर्तन केवल α-गैल (चित्रा 5) की तुलना में टिक लार के साथ इलाज की गई मछली में अधिक स्पष्ट था। उपचार के लिए विभिन्न प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आरटी-पीसीआर (तालिका 3) द्वारा सबसे प्रतिनिधि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया निर्माताओं (आईएफएन, टीएलआर 2, आईएल 1 β और एकेआर 2) की अभिव्यक्ति का अतिरिक्त विश्लेषण किया गया था। परिणामों ने गुर्दे में ज़ेबराफिश समूहों के बीच अंतर दिखाया, जहां नियंत्रण समूह (चित्रा 6) की तुलना में लार और α-गैल के साथ इलाज की गई मछली में सबसे अधिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्कर डाउनरेगुलेटेड दिखाई दिए, लेकिन आंत में जीन अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। ज़ेब्राफिश में विभिन्न टिक लार घटकों के लिए एलर्जी प्रतिक्रियाओं के बारे में पिछले अध्ययनों नेसमान परिणाम दिखाए। इसके अतिरिक्त, प्रतिनिधि परिणामों के रूप में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके टिक लार और α-गैल के साथ इलाज किए गए ज़ेब्राफिश ने α-गैल के खिलाफ आईजीएम एंटीबॉडी विकसित किए, जो पीबीएस (चित्रा 7) के साथ इलाज की गई मछली की तुलना में उच्च स्तर दिखाते हैं, जैसा कि पिछलेअध्ययनों 27,30 में पाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: ज़ेबराफिश परीक्षण के लिए प्रायोगिक डिजाइन। मछली को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में α-गैल, टिक लार और पीबीएस के साथ इंट्राडर्मल इंजेक्शन दिया जाता है। एक मछली के मरने के बाद या प्रयोग के अंत में नमूने एकत्र किए जाते हैं। नमूने का उपयोग एंटी-α-गैल आईजीएम स्तरों के विश्लेषण और क्यूआरटी-पीसीआर27 द्वारा चयनित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जीन मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए किया जा सकता है। पूरे प्रयोग में व्यवहार परिवर्तन या एलर्जी प्रतिक्रियाएं दर्ज की जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ज़ेबराफिश प्रायोगिक सुविधा। ज़ेबराफिश को 14 घंटे / 10 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ 27 डिग्री सेल्सियस पर प्रवाह-माध्यम जल प्रणाली में बनाए रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ज़ेबराफिश उपचार इंजेक्शन। 1 सेमी, 29 ग्राम सुई के साथ फिट किए गए 100 μL सिरिंज के साथ ज़ेब्राफिश उपचार इंजेक्शन पुच्छल पंख से 5 मिमी की दूरी पर इंट्राडर्मल रूप से किया जाता है। मछली को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और गर्म पानी में डुबोए गए स्पंज पर एक-एक करके इलाज किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ज़ेब्राफिश में एनाफिलेक्टिक-प्रकार की रक्तस्रावी प्रतिक्रियाओं के सबूत टिक लार के साथ इंजेक्ट किए गए और जो भोजन परिवर्तन से पहले दिन 2 पर मर गए। (ए) उपचार के बाद टैंक में एलर्जी प्रतिक्रियाओं वाली मछली। (बी) रक्तस्रावी एनाफिलेक्टिक प्रतिक्रियाओं (एलर्जी प्रतिक्रिया प्रकार: मलिनकिरण और त्वचा की लालिमा) से मृत मछली। (ग) नमूना संग्रह। लाल तीर आंत का संकेत देते हैं और लाल घेरे गुर्दे का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मछली में देखा गया व्यवहार पैटर्न। असामान्य व्यवहार पैटर्न में धीमी तैराकी, पानी की टंकी के तल पर स्थिर खड़े होना और ज़िगज़ैग तैराकी शामिल थी। नीले तीर उपचार के समय को इंगित करते हैं, और लाल तीर मछली के फ़ीड से कुत्ते के फ़ीड में बदलने के समय को इंगित करता है। कुत्ते के भोजन के साथ खिलाई गई मछली की तुलना लार-उपचारित और पीबीएस-उपचारित नियंत्रण मछली के बीच एक तरफ़ा एनोवा परीक्षण (पी = 0.05; पी = 0.05) द्वारा की गई थी। एन = 5 मछली / समूह)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: जेब्राफिश किडनी में चयनित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्करों की अभिव्यक्ति। प्रयोग के अंत में ज़ेबराफिश के गुर्दे में क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एमआरएनए सीटी मानों को डी. रेरियो जीएपीडीएच के खिलाफ सामान्यीकृत किया जाता है, जिसे औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और असमान भिन्नता के साथ छात्र टी-टेस्ट द्वारा लार, α-गैल और पीबीएस-उपचारित नियंत्रण समूह के साथ इलाज की गई मछली के बीच तुलना की जाती है (* पी < 0.05; एन = 3-7)। इस आंकड़े को27 से अपनाया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: आईजीएम एंटीबॉडी टिटर्स। α-गैल के खिलाफ ज़ेबराफिश के आईजीएम एंटीबॉडी टिटर्स एलिसा द्वारा निर्धारित किए जाते हैं, जिसे 450 एनएम पर एसडी ओडी ± औसत के रूप में दर्शाया जाता है और लार, α-गैल और पीबीएस-उपचारित नियंत्रण समूह के साथ इलाज की गई मछलियों के बीच तुलना असमान भिन्नता के साथ छात्र टी-टेस्ट द्वारा की जाती है (* पी < 0.005; एन = 3-7)। इस आंकड़े को27 से अपनाया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: घावों और व्यवहार पैटर्न का मूल्यांकन किया गया। गुणात्मक चर का वर्गीकरण। गुणात्मक रूप से मूल्यांकन किए जाने वाले मापदंडों में चोटें (पंख और तराजू पर), तैराकी, भोजन और क्या मछली की मृत्यु परीक्षण या हैंडलिंग के कारण होती है। एक व्यक्तिपरक विचार के रूप में, प्रत्येक चर को बहुत हल्के से गंभीर तक वर्गीकृत किया गया है कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: क्यूआरटी-पीसीआर के लिए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर और एनीलिंग तापमान। इस तालिका को30 से अपनाया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: प्रतिनिधि परिणाम। जेब्राफिश एलर्जी और मौतों के रिकॉर्ड और चयनित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण जेब्राफिश के गुर्दे और आंत में क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा किया जाता है। एमआरएनए सीटी मानों को डी. रेरियो जीएपीडीएच के खिलाफ सामान्यीकृत किया जाता है और असमान भिन्नता के साथ छात्र टी-टेस्ट द्वारा लार, α-गैल और पीबीएस-उपचारित नियंत्रण समूह के साथ इलाज की गई मछली के बीच तुलना की जाती है (* पी < 0.05; एन = 3-7)। इस तालिका को27,30 से अपनाया गया है और अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फिल्म 1: एनेस्थेटाइज्ड मछली। एनेस्थेटाइज्ड मछली आंदोलन या तैरना नहीं दिखाती है लेकिन सांस लेना जारी रखती है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2: मछली में उपचार का इंजेक्शन। मछली को गीले स्पंज पर एनेस्थेटाइज्ड रखा जाता है और संकेतित उपचार के साथ उनके शरीर में 45 डिग्री कोण पर इंजेक्ट किया जाता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 3: गिल-रक्त वाहिकाओं से सीरम संग्रह। मछली को पिन के साथ एक पैराफिन प्लेट पर तय किया जाता है और सीरम को 1 सेमी, 29 ग्राम सुई के साथ फिट किए गए 0.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके गिल्स से एकत्र किया जाता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 4: एक इच्छामृत्यु मछली से आंत संग्रह। मछली को स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके काटा जाता है और आंत को चिमटी के साथ एकत्र किया जाता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 5: एक इच्छामृत्यु मछली से किडनी संग्रह। तैरने वाले मूत्राशय को हटा दिया जाता है, और गुर्दे एकत्र किए जाते हैं। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 6: इलाज किए गए ज़ेबराफिश में देखे गए प्रतिनिधि व्यवहार पहलू। एक मछली ने धीमी गति से तैराकी दिखाई। एक ही समूह की सभी मछलियां एक ही टैंक में हैं, वीडियो इस व्यवहार को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण है, और कई मछलियों में दिन के अलग-अलग समय पर यह व्यवहार हो सकता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 7: इलाज किए गए ज़ेबराफिश में देखे गए प्रतिनिधि व्यवहार पहलू। एक मछली टैंक के तल पर रहती थी। एक ही समूह की सभी मछलियां एक ही टैंक में हैं, वीडियो इस व्यवहार को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण है, और कई मछलियों में दिन के अलग-अलग समय पर यह व्यवहार हो सकता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 8: इलाज किए गए ज़ेबराफिश में देखे गए प्रतिनिधि व्यवहार पहलू। एक मछली ने कंपन तैराकी दिखाई। एक ही समूह की सभी मछलियां एक ही टैंक में हैं, वीडियो इस व्यवहार को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण है, और कई मछलियों में दिन के अलग-अलग समय पर यह व्यवहार हो सकता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ज़ेबराफ़िश एक लागत प्रभावी और आसानी से संभालने वाला मॉडल है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, रोगज़नक़ रोगों, नई दवा परीक्षण, और टीकाकरण और संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा के आणविक तंत्रके अध्ययन के लिए एक बहुत ही व्यवहार्य उपकरण रहा है। ज़ेबराफिश के व्यवहार पर अध्ययन उपयोगी है क्योंकि पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि कुछ मछली प्रजातियां तनावग्रस्त होने पर टैंक के तल पर गतिहीन रहती हैं, जो उनके भोजन की खपत को प्रभावित करती हैं, कम खाती हैं; इसके अलावा, जब वे चलते हैं तो जिगज़ैगिंग मछली के तनाव और चिंता36,37 से भी जुड़ा हो सकता है। ज़ेबराफ़िश में इन मापदंडों का मूल्यांकन करके अध्ययनों से उत्पन्न जानकारी α-गैल के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल टिक-होस्ट आणविक इंटरैक्शन और तंत्र की मौलिक समझ प्रदान करेगी जो स्तनधारी मांस की खपत से एलर्जी सहित एजीएस के विकास का कारण बन सकती है।

इंजेक्शन वाले अणु के लिए झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए, जेब्राफिश शरीर के समानांतर बहुत गहराई से इंट्राडर्मल इंजेक्शन नहीं करना महत्वपूर्ण है, और यह मूल्यांकन करने के लिए कि इंजेक्शन के समय मछली क्षतिग्रस्त हो गई है या नहीं। हैंडलिंग या सुई के प्रवेश के परिणामस्वरूप चोट वाली मछली को विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि ज़ेबराफिश के ज्ञान वाला एक पेशेवर इस मॉडल 38 के साथ काम करने के अनुभव और अपनी पृष्ठभूमि के आधार पर व्यवहारपरिवर्तनों पर विचार करने के लिए तैराकी और भोजन जैसे व्यवहार में परिवर्तन का मूल्यांकन करता है। एक और महत्वपूर्ण विचार संज्ञाहरण है; एकत्र किए गए नमूनों की इष्टतम स्थिति के लिए पर्याप्त खुराक महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इंजेक्शन उपचार के दौरान, एक अधिक स्पष्ट तनाव प्रतिक्रिया से बचा जाता है, जो तनाव निदान से संबंधित संभावित कठिनाइयों की भरपाई करसकता है।

परिणामों से पता चला है कि ज़ेबराफिश मॉडल टिक काटने और अन्य एलर्जी प्रतिक्रियाओं के बाद एजीएस के विकास के जोखिमों का मूल्यांकन करने की संभावनाओं को भी आगे बढ़ा सकता है। इसके अलावा, इन एलर्जी के निदान, उपचार और रोकथाम के लिए लक्ष्य मनुष्यों पर लागू किए जा सकते हैं, क्योंकि यह विधि और मूल्यांकन किए गए पैरामीटर ज़ेब्राफिश में एलर्जी प्रतिक्रियाओं के अधिक सटीक लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं।

यह विधि अन्य लार बायोजेनिक अणुओं को मूल्यांकन करने की अनुमति दे सकती है, जो एलर्जी प्रतिक्रियाओं के लिए जिम्मेदार हैं और टिक लार में मौजूद हैं। टिक लार में α-गैल सामग्री को पहले27 निर्धारित किया गया है, लेकिन यह ज्ञात नहीं है कि एजीएस के विकास में अन्य यौगिक क्या शामिल हो सकते हैं। टिक लार और α-गैल के साथ इलाज किए गए समूहों में एलर्जी प्रतिक्रियाएं देखी गईं, लेकिन पीबीएस समूहों (तालिका 3) में नहीं, हालांकि α-गैल समूह की तुलना में टिक लार-उपचारित समूह में व्यवहार अधिक प्रभावित होता है (चित्रा 5)। इस डेटा से, हमारी परिकल्पना यह होगी कि अल्फा-गैल के साथ संयोजन में अन्य बायोमोलेक्यूल्स एजीएस में शामिल हैं, इसलिए आगे के प्रयोगों का अध्ययन करना चाहिए कि लार में मौजूद अन्य अणुओं का इन निष्कर्षों पर प्रभाव पड़ता है। इसके अतिरिक्त, एंटी-अल्फा-गैल एंटीबॉडी टिटर्स टिक लार और अल्फा-गैल के साथ इलाज किए गए ज़ेब्राफिश में काफी अधिक थे, जो पिछलेअध्ययनों 26,29 की तरह, टिक लार में मौजूद अल्फा-गैल के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दिखाते हैं (चित्रा 7)।

अंत में, पीबीएस उपचारित समूह (तालिका 3 और चित्रा 6) की तुलना में टिक लार और अल्फा गैल के साथ इलाज किए गए ज़ेब्राफिश समूहों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्कर डाउनरेगुलेटेड दिखाई दिए। ये परिणाम अन्य अध्ययनों में प्राप्त किए गए परिणामों के अनुरूप हैं, जहां अन्य एजीएस-संबंधित बायोमोलेक्यूल्स का परीक्षण किया गया था, लेकिनपिछले अध्ययनों 25 के विपरीत जहां टिक काटने और लाल मांस की खपत के जवाब में α-गैल केओ चूहों ने आईजीई प्रतिक्रिया और भड़काऊ टोल-जैसे रिसेप्टर (टीएलआर) और आईएल -1 सिग्नलिंग मार्गों की अनियमित अभिव्यक्ति दिखाई, जिसके परिणामस्वरूप एक्र 2 की सक्रियता हुई। इसलिए, ज़ेब्राफिश में टिक लार और अन्य बायोमोलेक्यूल्स के लिए इन प्रतिक्रियाओं के सक्रियण मार्गों को समझने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जो इस पद्धति के आवेदन से प्राप्त किए जा सकते हैं।

फिर, यह पद्धति बायोमोलेक्यूल्स के लिए स्क्रीनिंग की अनुमति दे सकती है जो अकेले या संयोजन में एलर्जी प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करती है और जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकती है जिससे एजीएस और अन्य टिक-जनित एलर्जी जैसे एलर्जी रोग होसकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम मछली प्रयोगात्मक सुविधा के साथ प्रयोगात्मक डिजाइन और तकनीकी सहायता में उनके सहयोग के लिए साबियो समूह के सदस्यों और ज़ेबराफिश प्रदान करने के लिए जुआन गालसेरन सेज़ (आईएन-सीएसआईसी-यूएमएच, स्पेन) को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को मिनिस्टरियो डी सिएनशिया ई इनोवासियोन / एगेनसिया एस्टैटल डी इन्वेस्टिगासियोन एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033, स्पेन और ईयू-फेडर (ग्रांट बायोगल पीआईडी 2020-116761 जीबी-आई00) द्वारा समर्थित किया गया था। मेरिनेला कॉन्ट्रेरास को मिनिस्टरियो डी सिएन्सिया, इनोवासियोन वाई यूनिवर्सिडेस, स्पेन, अनुदान IJC2020-042710-I द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube VWR 525-0990
All Prep DNA/RNA Qiagen 80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23225
Disection set VWR 631-1279
Dog Food - Red Classic Acana
ELISA plates-96 well Thermo Fisher Scientific 10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)  Dextra NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix Supermix 1708840
Microliter syringes Hamilton 7638-01
Plate reader any
Phosphate buffered saline Sigma P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride  Sigma P6503
Pipette tip P10  VWR 613-0364
Pipette tip P1000 VWR 613-0359
Premium food tropical fish DAPC
Sponge Animal Holder  Made from scrap foam
Stereomicroscope any
Thermal Cycler Real-Time PCR any
Tricaine methanesulphonate (MS-222) Sigma E10521

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References

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टिक सलाइवा बायोमोलेक्यूल्स के जवाब में एलर्जी प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए ज़ेबराफिश पशु मॉडल
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Contreras, M., González-García, A., de la Fuente, J. Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules. J. Vis. Exp. (187), e64378, doi:10.3791/64378 (2022).

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