Summary
Her bruges zebrafisk (Danio rerio) som model til at studere allergiske reaktioner og immunresponser relateret til alfa-Gal syndrom (AGS) ved at evaluere allergiske reaktioner på flåtspyt og pattedyrs kødforbrug.
Abstract
Flåter er leddyrvektorer, der forårsager sygdom ved patogenoverførsel, og hvis bid kan være relateret til allergiske reaktioner, der påvirker menneskers sundhed over hele verden. Hos nogle individer er høje niveauer af immunglobulin E-antistoffer mod glycanen Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) blevet induceret af flåtbid. Anafylaktiske reaktioner medieret af glycoproteiner og glycolipider indeholdende glycan α-Gal, der er til stede i flåtspyt, er relateret til alfa-Gal syndrom (AGS) eller pattedyrs kødallergi. Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en meget anvendt hvirveldyrmodel til undersøgelse af forskellige patologier. I denne undersøgelse blev zebrafisk brugt som model for undersøgelsen af allergiske reaktioner som reaktion på α-Gal og pattedyrs kødforbrug, fordi de ligesom mennesker ikke syntetiserer denne glykan. Til dette formål blev adfærdsmønstre og hæmoragiske anafylaktiske allergiske reaktioner som reaktion på Ixodes ricinus tick spyt og pattedyrs kødforbrug evalueret. Denne eksperimentelle tilgang gør det muligt at indhente gyldige data, der understøtter zebrafiskens dyremodel til undersøgelse af flåtbårne allergier, herunder AGS.
Introduction
Flåter er vektorer af patogener, der forårsager sygdomme og er også årsagen til allergiske reaktioner, der påvirker menneskers og dyrs sundhed over hele verden 1,2. Under flåtfodring letter biomolekyler i krydsspyt, især proteiner og lipider, fodring af disse ektoparasitter og undgår værtsforsvar3. Nogle spytbiomolekyler med glycan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifikationer fører til produktion af høje anti-α-Gal IgE-antistofniveauer efter flåtbiddet, kun hos nogle individer, som er kendt som α-Gal syndrom (AGS)4. Dette er en sygdom forbundet med IgE-medieret allergi, der kan resultere i anafylaksi til flåtbid, ikke-primatpattedyrs kødforbrug og nogle lægemidler såsom cetuximab5. Reaktioner på α-Gal er ofte alvorlige og kan undertiden være dødelige 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
α-Gal findes i alle pattedyr undtagen aber, aber og mennesker fra den gamle verden, der ikke har evnen til at syntetisere α-Gal13. Imidlertid udtrykker patogener som bakterier og protozoer denne glycan på deres overflade, hvilket kan fremkalde produktion af store mængder anti-α-Gal IgM / IgG-antistoffer og kan være en beskyttelsesmekanisme mod disse patogener16,17. Imidlertid øger produktionen af anti-α-Gal-antistoffer risikoen for at udvikle IgE-medierede anti-α-Gal-allergier 7,13. Naturlige anti-α-Gal-antistoffer produceret hos mennesker, hovedsageligt af IgM/IgG-undertyperne, kunne være forbundet med denne modifikation, der findes i bakterier fra tarmmikrobiota16. AGS kan være en udfordrende klinisk diagnose, da den vigtigste diagnostiske metode i øjeblikket er baseret på en klinisk historie med forsinkede allergiske reaktioner, især forbundet med fødevareallergier (dvs. kløe, lokaliserede nældefeber eller tilbagevendende angioødem til anafylaksi, urticaria og gastrointestinale symptomer) og måling af IgE-anti-α-Gal-antistofniveauer9. Aktuelle resultater tyder på, at flåtbid udgør en af de største risici ved forekomsten af AGS 18,19, en 20 gange eller større stigning i IgE-niveauer til α-Gal efter et flåtbid 19, en historie med flåtbid hos patienter med AGS20,21,22, eksistensen af antistoffer, der er reaktive over for flåtantigener hos AGS-patienter 19, og at anti-α-Gal IgE er stærkt relateret til anti-tick IgE-niveauer19,23, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere, hvilke biomolekyler der faktisk er involveret.
Derudover er et andet muligt scenario patienter, der udviser stærke allergiske reaktioner på flåtbid og høje niveauer af anti-α-Gal IgE-antistoffer, men er tolerante over for pattedyrs kødforbrug12. Derfor kan pattedyrs kødallergi være en særlig type flåtbidrelateret allergi. De vigtigste flåtarter, der er forbundet med AGS, omfatter Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasilien), Amblyomma testudinarium og Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australien) og Ixodes ricinus (den vigtigste vektor for borreliose i Europa)11,24.
Den eneste model, der er blevet brugt til at evaluere IgE-produktion relateret til flåtbid, er musemodellen genetisk modificeret med genet for α-1,3-galactosyltransferase slået ud (α-Gal KO) mus25,26, fordi mus ligesom andre pattedyr også udtrykker α-Gal på proteiner og lipider og ikke producerer IgE til α-Gal. Zebrafisk (Danio rerio) er imidlertid en nyttig model for biomedicinsk forskning anvendt på pattedyr, fordi den deler mange anatomiske ligheder med pattedyr og ligesom mennesker heller ikke er i stand til at syntetisere α-Gal. Da α-Gal ikke produceres naturligt i zebrafisk, er det en overkommelig model, let at manipulere og tillader en høj prøvestørrelse til undersøgelse af α-Gal-relaterede allergiske reaktioner.
I denne undersøgelse anvendes zebrafisk som modelorganisme til at karakterisere og beskrive lokale allergiske reaktioner, adfærdsmønstre og de molekylære mekanismer, der er forbundet med respons på perkutan sensibilisering over for flåtspyt26,27 og efterfølgende kødforbrug hos pattedyr. Til dette formål udsættes fisk for flåtspyt ved intradermal injektion og fodres derefter med hundefoder, der indeholder kødafledte produkter fra pattedyr, der er egnede til dyrebrug, og som indeholder α-Gal27, hvorefter mulige relaterede allergiske reaktioner vurderes. Denne metode kan anvendes til undersøgelse af andre biomolekyler relateret til allergiske processer, især dem, der er relateret til AGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af den etiske komité for dyreforsøg ved University of Castilla La Mancha under undersøgelsen "Evaluering af immunresponset på inaktiveret M. bovis vaccine og udfordring med M. marinum i zebrafiskens modelnummer PR-2017-05-12."
Flåter blev opnået fra laboratoriekolonien, hvor repræsentative prøver af flåter i kolonien blev testet af PCR for almindelige flåtpatogenerfor at bekræfte fraværet af patogener og vedligeholdt ved Institut for Parasitologi, Biologicentret for det tjekkiske videnskabsakademi (IP BC CAS), Tjekkiet.Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Tjekkiets dyrebeskyttelseslov nr. 246/1992 Sb (etisk godkendelse nr. 34/2018).
1. Zebrafisk behandling
BEMÆRK: Forsøget er designet til at evaluere allergiske reaktioner og immunresponset hos zebrafisk behandlet med flåtspyt som reaktion på pattedyrs kødforbrug.
- Fisken (som forklaret i punkt 4) behandles med flåtspyt, kommerciel Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (se materialetabel), anvendt som positiv kontrol, med fosfatbufret saltvand (PBS) som negativ kontrol. Voksne zebrafisk er tilfældigt fordelt i tre kønsbalancerede grupper (figur 1).
BEMÆRK: Enhver anden ønsket forbindelse relateret til AGS kan evalueres ved hjælp af denne model.
2. Ixodes ricinus tick spyt ekstraktion
- Brug semi-engorged patogenfrie kvindelige flåter fodret i 6-7 dage på marsvin.
- Flåten behandles med 5 μL af en 2% (vægt/vol) opløsning af pilocarpinhydrochlorid i PBS (se materialetabel) ved pH 7,4 i hæmokoel ved hjælp af en 50 μL sprøjte med en 0,33 mm kanyle som tidligere beskrevet28 for at fremkalde flåtspytproduktion.
BEMÆRK: Flåter håndteres ved hjælp af tang; Vær forsigtig med ikke at anvende for meget styrke, når du griber dem. - Opsaml spyt ved hjælp af en 10 μL spids monteret på en mikropipette.
- Indfør spidsen inde i krydshypostomet omhyggeligt.
- Opbevar spyttet i et 1,5 ml rør på is, saml det og opbevar det ved -80 °C som tidligere beskrevet27.
- Bestem spytproteinkoncentrationen for at bestemme mængden af protein, der skal injiceres i fisken som i tidligere undersøgelser27 ved hjælp af et BCA-proteinanalysesæt (se materialetabel) efter producentens anbefalinger.
3. Vedligeholdelse af zebrafisk
- Hold zebrafisk i et gennemstrømningsvandsystem ved 27 °C med en lys/mørk cyklus på 14 timer/10 timer (figur 2).
- Fodres fisken to gange dagligt kl. 9.30 og 13.30 med tørfoder (50-70 μg/fisk) indtil dag 2.
- Fiskene fodres to gange dagligt kl. 9.30 og 13.30 med tørfoder til hunde (50-70 μg/fisk) fra dag 2 efter injektionen til forsøgets afslutning
4. Zebrafisk injektion
- Vælg 10 fisk pr. gruppe med et lignende forhold mellem hunner og hanner og lignende vægt.
BEMÆRK: Gruppe 1 indeholder fisk injiceret med PBS, gruppe 2 indeholder fisk injiceret med flåtspyt, og gruppe 3 indeholder fisk injiceret med α-Gal. - Bedøv fisken kortvarigt ved nedsænkning i 0,02% tricainmethansulfonat (MS-222) (film 1).
BEMÆRK: Korrekt bedøvede fisk viser normal vejrtrækning og ingen svømning, mens de kunne placeres i bunden af vandtanken eller flyde. Hver fisk skal bedøves individuelt for at undgå mulig fysiologisk skade. - Fang den bedøvede fisk ved hjælp af et fiskenet.
- Placer fisken på sin halve side ved hjælp af tang eller hænder forsigtigt på en våd svamp med halefinnen på højre side for at injicere forbindelserne i samme retning for at kontrollere læsionerne.
- Som i tidligere undersøgelser26 injiceres grupper af fisk intradermalt i musklen ved 5 mm til halefinnen og i en vinkel på 45° i forhold til fiskens krop (film 2). Brug den passende behandling på dag 0, 3 og 8 som tidligere beskrevet 27 med en 100 μL sprøjte forsynet med en 1 cm, 29 G kanyle med 1 μL (med 9 μg/μL protein) I. ricinus spyt i 10 μL PBS (flåtspyt), 5 μg α-Gal i 10 μL PBS (α-Gal)27, og 10 μL PBS (figur 3).
BEMÆRK: Håndtering skal ske hurtigt og omhyggeligt for at undgå fysisk skade på dyret.
Andre biomolekyler i flåtspyt kan evalueres efter denne protokol. - Placer den behandlede fisk tilbage i en ferskvandstank uden bedøvelse til genopretning.
BEMÆRK: Alle fisk i samme gruppe kan placeres i samme vandtank til genopretning.
5. Zebrafisk fodring
- Mos hundemaden med en mørtel og støder.
- Foder 50-70 μg/fisk to gange dagligt kl. 9.30 og 13.30 med tørfoder indtil dag 2.
- 50-70 μg/fisk fodres to gange dagligt kl. 9.30 og kl. 13.30 med moset hundefoder fra dag 2 efter injektionen til forsøgets afslutning på dag 8.
BEMÆRK: Hvis immunitetsmarkører eller antistoftitere mod α-Gal- eller IgE-antistoffet som reaktion på behandlingerne eller foderet gennem de forskellige podninger skal evalueres, vil fodring være nødvendig indtil forsøgets afslutning.
6. Evaluering af allergiske reaktioner, læsioner og adfærd hos zebrafisk
- Undersøg den hæmoragiske type allergiske reaktioner (rødme, misfarvning og blødning) ved hjælp af et forstørrelsesglas eller stereomikroskop for nøjagtighed og angiv placeringen af deres udseende på fisken efter kategoriseringen i tabel 1 (figur 4A).
BEMÆRK: De allergiske reaktioner, der er vist i figur 4 , optrådte efter injektion af krydsspyt og forbruget af foder indeholdende rødt kød. Derfor er de beskrevne reaktioner den type reaktioner, der er forbundet med AGS, da lignende reaktioner forekommer i klinisk sammenhæng.- Overhold om der opstår nogen reaktion efter behandlinger og under administration af mad to gange om dagen, mens fisken er i vandtanken.
- Undersøg fiskens adfærd ved at evaluere ændringerne27 i svømmemønstre (mobilitet, hastighed, stående ubevægelig i bunden af vandtanken og zigzagsvømning) efter kategoriseringen i tabel 1.
- Evaluer akkumuleret dødelighed med angivelse af antallet af døde fisk, herunder tidspunkt/dødsdag (figur 4B).
BEMÆRK: Alle parametre evalueres lige efter behandling eller efter foderskift og følges dagligt indtil forsøgets afslutning på dag 8 med kategorisering af kvalitative variabler (tabel 1). Som en anbefaling bør denne evaluering udføres af en professionel med viden om zebrafisk for at overveje adfærdsændringer baseret på deres baggrund og erfaring med at arbejde med denne dyremodel. - Beregn antallet af zebrafisk om dagen med rapporterede allergiske reaktioner, unormal adfærd og fodringsændringer i hver gruppe og sammenlign mellem grupper ved en envejs ANOVA test.
7. Indsamling af prøver
- Aflive fisken ved nedsænkning i 0,04% MS-222 på dag 8.
BEMÆRK: Indsaml også prøverne fra de fisk, der dør af allergiske reaktioner under forsøget. - Fastgør fisken på en paraffinplade med stifter.
- Opsaml serum fra fiskens gælleblodkar 29 umiddelbart efter eutanasi, når gællerne stadig er vandet med blod, ved hjælp af en 0,5 ml sprøjte udstyret med en 1 cm,29 G nål. Opbevar den i et 1,5 ml rør ved -20 °C indtil brug (film 3).
- Skær fisken sagittalt med et skalpelblad og vurder de indre læsioner (hæmoragiske læsioner eller granulomer)27,30, hvis de vises.
BEMÆRK: Læsioner forekommer ikke nødvendigvis, men skal registreres, hvis de gør. - Tarmen (film 4) og nyren (film 5) samles fra hver fisk i separate tomme 1,5 ml rør, som tidligere beskrevet31, og opbevar dem ved -80 C (figur 4C).
- Uddrag total RNA fra zebrafiskens tarm- og nyreprøver ved hjælp af et RNA-oprensningssæt (se materialetabel).
- Analyser ekspressionen af gener relateret til immunrespons som tidligere beskrevet30,32 (se tabel 2 for primersekvenser) i zebrafisk, der udfører en kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-qPCR) ved hjælp af en revers transkriptionsblanding for RT-qPCR (se materialetabel) i henhold til producentens anvisninger. Normaliser mRNA cT-værdierne mod D. rerio GAPDH, og sammenlign mellem grupper (fisk behandlet med spyt, α-Gal og de PBS-behandlede grupper) ved hjælp af en Student t-test med ulige varians.
- Bestem IgM-antistoftitere, der genkender α-Gal i zebrafisk i serumprøver med ELISA som beskrevet tidligere 27,30. Registrer antistoftiterne som O.D.450 nm-værdier ved hjælp af en pladelæser, og sammenlign mellem grupper (fisk behandlet med spyt, α-Gal og de PBS-behandlede grupper) ved hjælp af en Student t-test med ulige varians.
BEMÆRK: Bestemmelse af IgM-antistoftitere og ekspressionsgenanalyse er valgfri og udføres kun, hvis immunologiske oplysninger er påkrævet. RT-qPCR-blanding er et førstestrenget cDNA-syntesesæt til genekspressionsanalyse ved hjælp af qPCR i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen, der præsenteres her, er baseret på flere aspekter af tidligere offentliggjorte eksperimenter27,30 og resultater udført i vores laboratorium, hvor zebrafiskmodellen er etableret og valideret til undersøgelse af AGS og immunresponset på α-Gal, fordi både mennesker og zebrafisk ikke syntetiserer dette molekyle13. Denne model tillader karakterisering og evaluering af en række allergiske reaktioner som følge af værtsresponset på krydsspyt (figur 4) og deres implikation i AGS. Derudover observeres ændringer i adfærd såsom langsom svømning (film 6), liggende på bunden af tanken (film 7) og ikke spise, vibrere eller zigzaggende bevægelse (film 8) hos fisken som reaktion på krydsspytbehandling, der ikke observeres i kontrolfisken; Disse fund er særligt signifikante efter administration af hundemad på dag 2. På dette tidspunkt var fisken allerede sensibiliseret med alfa-gal og krydsspyt, og administrationen af rødt kød gennem foderet begyndte. Endelig observeres en signifikant forekomst af allergiske reaktioner hos fisk behandlet med flåtspyt (figur 4A, B og tabel 3), kun zebrafisk, der havde været udsat for flåtspyt, udviklede allergiske reaktioner, der viste hurtig desensibilisering og tolerance. På den anden side udviklede zebrafisk fodret med fiskemad i tidligere undersøgelser ikke nogen synlig læsion eller reaktion27. Adfærdsændringen var mere udtalt hos fisken behandlet med flåtspyt end hos blot α-Gal (figur 5). Yderligere analyse af ekspressionen af de mest repræsentative immunresponsproducenter (IFN, TLR 2, IL1 β og AKR2) blev udført af RT-PCR (tabel 3) for at studere forskellige immunresponser på behandlingerne. Resultaterne viste forskelle mellem zebrafiskgrupper i nyrerne, hvor de fleste immunresponsmarkører syntes at være nedreguleret hos fisk behandlet med spyt og α-Gal sammenlignet med kontrolgruppen (figur 6), men der blev ikke fundet signifikante forskelle i genekspression i tarmen. Tidligere undersøgelser om allergiske reaktioner på forskellige flåtspytkomponenter hos zebrafisk viste lignende resultater27. Derudover udviklede zebrafisk behandlet med flåtspyt og α-Gal ved hjælp af denne protokol som repræsentative resultater IgM-antistoffer mod α-Gal, der viste højere niveauer end hos fisk behandlet med PBS (figur 7), som det blev fundet i tidligere undersøgelser27,30.
Figur 1: Eksperimentelt design for zebrafiskforsøg. Fisk injiceres intradermalt med α-Gal, krydsspyt og PBS som en negativ kontrol. Prøver indsamles efter en fisk dør eller i slutningen af eksperimentet. Prøver kunne anvendes til analyse af anti-α-Gal IgM-niveauer og ekspression af udvalgte immunresponsgenmarkører ved qRT-PCR27. Adfærdsændringer eller allergiske reaktioner registreres under hele eksperimentet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Zebrafisk forsøgsanlæg. Zebrafiskene holdes i et gennemstrømningsvandsystem ved 27 °C med en lys/mørk cyklus på 14 timer/10 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Injektion af zebrafiskbehandling. Zebrafisk behandling injektion med en 100 μL sprøjte udstyret med en 1 cm, 29 G kanyle udføres intradermalt i en afstand af 5 mm fra halefinnen. Fiskene bedøves og behandles en efter en over en svamp dyppet i varmt vand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Tegn på hæmoragiske reaktioner af anafylaktisk type hos zebrafisk injiceret med flåtspyt, og som døde på dag 2 før fodringsændring. (A) Fisk med allergiske reaktioner i tanken efter behandling. (B) Fisk, der er døde af hæmoragiske anafylaktiske reaktioner (allergisk reaktionstype: misfarvning og rødme af huden. (C) Indsamling af prøver. Røde pile angiver tarmen og røde cirkler angiver nyrerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Adfærdsmønster observeret hos fisk. Unormale adfærdsmønstre bestod af langsom svømning, stående stille i bunden af vandtanken og zigzagsvømning. Blå pile angiver behandlingstidspunktet, og den røde pil angiver tiden til at skifte fra fiskefoder til hundefoder. Fisk fodret med hundemad blev sammenlignet mellem spytbehandlede og PBS-behandlede kontrolfisk ved en envejs ANOVA test (p = 0,05; N = 5 fisk/gruppe). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Ekspression af udvalgte immunresponsmarkører i zebrafisknyre. Genekspressionsanalyse ved qRT-PCR i nyren af zebrafisk ved forsøgets afslutning. mRNA cT-værdierne normaliseres mod D. rerio GAPDH, præsenteret som gennemsnitlig ± SD og sammenlignes mellem fisk behandlet med spyt, α-Gal og den PBS-behandlede kontrolgruppe ved en Student t-test med ulige varians (*p < 0,05; N = 3-7). Dette tal er vedtaget fra27 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: IgM-antistoftitere. IgM-antistoftiterne af zebrafisk mod α-Gal bestemmes af ELISA, repræsenteret som den gennemsnitlige ± SD O.D. ved 450 nm og sammenlignet mellem fisk behandlet med spyt, α -Gal og den PBS-behandlede kontrolgruppe ved en Student t-test med ulige varians (*p < 0,005; N = 3-7). Dette tal er vedtaget fra27 og gengivet med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Læsioner og adfærdsmønstre evalueret. Kategorisering af kvalitative variabler. De parametre, der vurderes kvalitativt, er skader (på finner og skalaer), svømning, fodring og om fiskens død skyldes testen eller håndteringen. Som en subjektiv overvejelse er hver variabel kategoriseret fra meget mild til svær Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Oligonukleotidprimere og udglødningstemperaturer for qRT-PCR. Denne tabel er vedtaget fra30 og gengivet med tilladelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: Repræsentative resultater. Registreringer af zebrafiskallergi og -død og ekspression af udvalgte immunresponsmarkører analyseres ved qRT-PCR i zebrafiskens nyre og tarm. mRNA cT-værdierne normaliseres mod D. rerio GAPDH og sammenlignes mellem fisk behandlet med spyt, α -Gal og den PBS-behandlede kontrolgruppe ved en Student t-test med ulige varians (*p < 0,05; N = 3-7). Denne tabel er vedtaget fra27,30 og gengivet med tilladelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Film 1: Bedøvet fisk. Den bedøvede fisk viser ikke bevægelse eller svømmer, men fortsætter med at trække vejret. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Injektion af behandlingen i fisken. Fiskene lægges bedøvet på en våd svamp og injiceres i en 45 ° vinkel på deres krop med den angivne behandling. Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Serumopsamling fra gælle-blodkarrene. Fisken fastgøres på en paraffinplade med stifter, og serum opsamles fra gællerne ved hjælp af en 0,5 ml sprøjte udstyret med en 1 cm, 29 G nål. Klik her for at downloade denne film.
Film 4: Tarmsamling fra en aflivet fisk. Fisken skæres sagittalt ved hjælp af et skalpelblad, og tarmen opsamles med pincet. Klik her for at downloade denne film.
Film 5: Nyresamling fra en aflivet fisk. Svømmeblæren fjernes, og nyrerne opsamles. Klik her for at downloade denne film.
Film 6: Repræsentative adfærdsaspekter observeret hos behandlede zebrafisk. En fisk viste langsom svømning. Alle fisk fra samme gruppe er i samme tank, Videoen er et eksempel til at illustrere denne adfærd, og flere fisk kan have denne adfærd på forskellige tidspunkter af dagen. Klik her for at downloade denne film.
Film 7: Repræsentative adfærdsaspekter observeret hos behandlede zebrafisk. En fisk blev i bunden af tanken. Alle fisk fra samme gruppe er i samme tank, Videoerne er et eksempel til at illustrere denne adfærd, og flere fisk kan have denne adfærd på forskellige tidspunkter af dagen. Klik her for at downloade denne film.
Film 8: Repræsentative adfærdsaspekter observeret hos behandlede zebrafisk. En fisk viste vibrerende svømning. Alle fisk fra samme gruppe er i samme tank, Videoerne er et eksempel til at illustrere denne adfærd, og flere fisk kan have denne adfærd på forskellige tidspunkter af dagen. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisk er en omkostningseffektiv og let håndterbar model, der også har været et meget gennemførligt værktøj til undersøgelse af molekylære mekanismer for immunrespons, patogensygdomme, test af nye lægemidler og vaccination og beskyttelse mod infektioner33,34,35. Undersøgelsen af zebrafiskens adfærd er nyttig, da tidligere undersøgelser har vist, at nogle fiskearter forbliver ubevægelige i bunden af tanken, når de er stressede, hvilket påvirker deres fødeforbrug og spiser mindre; Derudover kan zigzagging, når de bevæger sig, også være forbundet med fiskens stress og angst36,37. De oplysninger, der genereres fra undersøgelser ved at evaluere disse parametre i zebrafisk, vil give en grundlæggende forståelse af de molekylære interaktioner og mekanismer, der er involveret i værtsimmunrespons på α-Gal, der kan føre til udvikling af AGS, herunder allergi over for pattedyrs kødforbrug.
For at undgå falske positive reaktioner på det injicerede molekyle er det vigtigt at udføre en intradermal injektion ikke særlig dybt, parallelt med zebrafiskens krop, og at vurdere, om fisken er beskadiget på injektionstidspunktet. Fisk med skader som følge af håndtering eller nåleindtrængning bør ikke medtages i analysen. Derudover anbefales det stærkt, at en professionel med kendskab til zebrafisk evaluerer ændringer i adfærd såsom svømning og fodring for at overveje adfærdsændringer baseret på deres baggrund og erfaring med at arbejde med denne model38. En anden vigtig overvejelse er anæstesi; En passende dosis er vigtig for den optimale tilstand af de indsamlede prøver. Derudover undgås der under injektionsbehandlingen et mere udtalt stressrespons, hvilket kan kompensere for mulige vanskeligheder i forbindelse med stressdiagnose29.
Resultaterne viste, at zebrafiskmodellen også kunne fremme mulighederne for at vurdere risikoen for at udvikle AGS efter et flåtbid og andre allergiske reaktioner. Endvidere kan mål for diagnose, behandlinger og forebyggelse af disse allergier anvendes på mennesker, da denne metode og de parametre, der evalueres, tillader mere præcis karakterisering af allergiske reaktioner hos zebrafisk.
Denne metode kan gøre det muligt at evaluere andre spytbiogene molekyler, der er ansvarlige for allergiske reaktioner og til stede i flåtspyt. α-Gal-indholdet i flåtspyt er tidligere blevet kvantificeret27, men det vides ikke, hvilke andre forbindelser der kan være involveret i udviklingen af AGS. Allergiske reaktioner blev observeret i grupper behandlet med flåtspyt og α-Gal, men ikke i PBS-grupper (tabel 3), men adfærd påvirkes mere i flåtspytgruppen end i α-Gal-gruppen (figur 5). Ud fra disse data ville vores hypotese være, at andre biomolekyler i kombination med alfa-Gal er involveret i AGS, så yderligere eksperimenter bør undersøge, hvilke andre molekyler der er til stede i spyt, der har indflydelse på disse fund. Derudover var anti-alfa-gal-antistoftitere signifikant højere hos zebrafisk behandlet med flåtspyt og alfa-gal, der som i tidligere undersøgelser26,29 viste et immunrespons på alfa-gal til stede i flåtspyt (figur 7).
Endelig forekom immunresponsmarkører nedreguleret i zebrafiskgrupper behandlet med flåtspyt og alfagal sammenlignet med PBS-behandlet gruppe (tabel 3 og figur 6). Disse resultater er i overensstemmelse med dem, der blev opnået i andre undersøgelser, hvor andre AGS-relaterede biomolekyler blev testet27, men i modsætning til tidligere undersøgelser25 , hvor α-Gal KO-mus som reaktion på flåtbid og rødt kødforbrug viste et IgE-respons og et opreguleret udtryk for inflammatoriske Toll-lignende receptor (TLR) og IL-1-signalveje, hvilket resulterede i aktivering af Akr2. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser for at forstå aktiveringsvejene for disse reaktioner på flåtspyt og andre biomolekyler i zebrafisk, der kunne opnås ved anvendelse af denne metode.
Derefter kan denne metode muliggøre screening for biomolekyler, der alene eller i kombination udløser allergiske reaktioner, og som kan påvirke værtens immunrespons, der fører til allergiske sygdomme såsom AGS og andre flåtbårne allergier27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af SaBio-gruppen for deres samarbejde i det eksperimentelle design og teknisk assistance med fiskeforsøgsanlægget og Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Spanien) for at levere zebrafisk. Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Spanien og EU-FEDER (tilskud BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras finansieres af Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien, tilskud IJC2020-042710-I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube | VWR | 525-0990 | |
| All Prep DNA/RNA | Qiagen | 80284 | |
| Aquatics facilities | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Disection set | VWR | 631-1279 | |
| Dog Food - Red Classic | Acana | ||
| ELISA plates-96 well | Thermo Fisher Scientific | 10547781 | |
| Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) | Dextra | NGP0203 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Supermix | 1708840 | |
| Microliter syringes | Hamilton | 7638-01 | |
| Plate reader | any | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-50TAB | |
| pilocarpine hydrochloride | Sigma | P6503 | |
| Pipette tip P10 | VWR | 613-0364 | |
| Pipette tip P1000 | VWR | 613-0359 | |
| Premium food tropical fish | DAPC | ||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| Stereomicroscope | any | ||
| Thermal Cycler Real-Time PCR | any | ||
| Tricaine methanesulphonate (MS-222) | Sigma | E10521 |
References
- de la Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13 (18), 6938-6946 (2008).
- de la Fuente, J., et al. Tick-pathogen interactions and vector competence: identification of molecular drivers for tick-borne diseases. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 114 (2017).
- Villar, M., et al. Characterization of tick salivary gland and saliva alphagalactome reveals candidate alpha-gal syndrome disease biomarkers. Expert Review of Proteomics. 18 (12), 1099-1116 (2021).
- Chmelař, J., Kotál, J., Kovaříková, A., Kotsyfakis, M. The use of tick salivary proteins as novel therapeutics. Frontiers in Physiology. 10, 812 (2019).
- Chung, C. H., et al. Cetuximab-induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The New England Journal of Medicine. 358 (11), 1109-1117 (2008).
- Van Nunen, S. A., O'Connor, K. S., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. The Medical Journal of Australia. 190 (9), 510-511 (2009).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Environmental and molecular drivers of the α-Gal syndrome. Frontiers in Immunology. 10, 1210 (2019).
- de la Fuente, J., Pacheco, I., Villar, M., Cabezas-Cruz, A. The alpha-Gal syndrome: new insights into the tick-host conflict and cooperation. Parasites & Vectors. 12 (1), 154 (2019).
- Platts-Mills, T. A. E., et al. On the cause and consequences of IgE to galactose-α-1,3-galactose: A report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases workshop on understanding IgE-mediated mammalian meat allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (4), 1061-1071 (2020).
- Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-alpha-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 123 (2), 426-433 (2009).
- Platts-Mills, T. A. E., Schuyler, A. J., Tripathi, A., Commins, S. P. Anaphylaxis to the carbohydrate side chain alpha-gal. Immunology and Allergy Clinics of North America. 35 (2), 247-260 (2015).
- Mateos-Hernández, L., et al. Tick-host conflict: immunoglobulin E antibodies to tick proteins in patients with anaphylaxis to tick bite. Oncotarget. 8 (13), 20630-20644 (2017).
- Galili, U. Evolution in primates by "Catastrophic-selection" interplay between enveloped virus epidemics, mutated genes of enzymes synthesizing carbohydrate antigens, and natural anti-carbohydrate antibodies. American Journal of Physical Anthropology. 168 (2), 352-363 (2019).
- Hilger, C., Fischer, J., Wölbing, F., Biedermann, T. Role and mechanism of galactose-alpha-1,3-galactose in the elicitation of delayed anaphylactic reactions to red meat. Current Allergy and Asthma Reports. 19 (1), 3 (2019).
- Cabezas-Cruz, A., Valdés, J., de la Fuente, J. Cancer research meets tick vectors for infectious diseases. The Lancet. Infectious Diseases. 14 (10), 916-917 (2014).
- Yilmaz, B., et al. Gut microbiota elicits a protective immune response against malaria transmission. Cell. 159 (6), 1277-1289 (2014).
- Cabezas-Cruz, A., et al. Regulation of the immune response to α-Gal and vector-borne diseases. Trends in Parasitology. 31 (10), 470-476 (2015).
- Weins, A. B., Eberlein, B., Biedermann, T. Diagnostics of alpha-gal syndrome: Current standards, pitfalls and perspectives. Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete. 70 (1), 36-43 (2019).
- Commins, S. P., et al. The relevance of tick bites to the production of IgE antibodies to the mammalian oligosaccharide galactose-α-1,3-galactose. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1286-1293 (2011).
- Fischer, J., Yazdi, A. S., Biedermann, T. Clinical spectrum of α-Gal syndrome: from immediate-type to delayed immediate-type reactions to mammalian innards and meat. Allergo Journal International. 25 (2), 55-62 (2016).
- Hodžić, A., et al. Infection with Toxocara canis inhibits the production of IgE antibodies to α-Gal in humans: towards a conceptual framework of the hygiene hypothesis. Vaccines. 8 (2), 167 (2020).
- Kiewiet, M. B. G., et al. Clinical and serological characterization of the α-Gal syndrome-importance of atopy for symptom severity in a European cohort. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. In Practice. 8 (6), 2027-2034 (2020).
- Steinke, J. W., Platts-Mills, T. A. E., Commins, S. P. The alpha-gal story: lessons learned from connecting the dots. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 589-596 (2015).
- Hashizume, H., et al. Repeated Amblyomma testudinarium tick bites are associated with increased galactose-α-1,3-galactose carbohydrate IgE antibody levels: A retrospective cohort study in a single institution. Journal of the American Academy of Dermatology. 78 (6), 1135-1141 (2018).
- Chandrasekhar, J. L., et al. Cutaneous exposure to clinically relevant lone star ticks promotes IgE production and hypersensitivity through CD4+ T cell- and MyD88-dependent pathways in mice. Journal of Immunology. 203 (4), 813-824 (2019).
- Araujo, R. N., et al. Amblyomma sculptum tick saliva: α-Gal identification, antibody response and possible association with red meat allergy in Brazil. International Journal for Parasitology. 46 (3), 213-220 (2016).
- Contreras, M., et al. Allergic reactions and immunity in response to tick salivary biogenic substances and red meat consumption in the zebrafish model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 78 (2020).
- Poole, N. M., Mamidanna, G., Smith, R. A., Coons, L. B., Cole, J. A. Prostaglandin E(2) in tick saliva regulates macrophage cell migration and cytokine profile. Parasites & Vectors. 6 (2), 261 (2013).
- Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood will tell: what hematological analyses can reveal about fish welfare. Frontiers in Veterinary Science. 8, 616955 (2021).
- Pacheco, I., et al. Vaccination with alpha-gal protects against mycobacterial infection in the zebrafish model of tuberculosis. Vaccines. 8 (2), 195 (2020).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), e1717 (2010).
- Lu, M. -W., et al. The interferon response is involved in nervous necrosis virus acute and persistent infection in zebrafish infection model. Molecular Immunology. 45 (4), 1146-1152 (2008).
- Saralahti, A., et al. Adult zebrafish model for pneumococcal pathogenesis. Developmental and Comparative Immunology. 42 (2), 345-353 (2014).
- Gore, A. V., Pillay, L. M., Venero Galanternik, M., Weinstein, B. M. The zebrafish: A fintastic model for hematopoietic development and disease. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 7 (3), 312 (2018).
- Katoch, S., Patial, V. Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery. Journal of Applied Toxicology. 41 (1), 33-51 (2021).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Xin, N., Jiang, Y., Liu, S., Zhou, Y., Cheng, Y. Effects of prednisolone on behavior and hypothalamic-pituitary-interrenal axis activity in zebrafish. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103325 (2020).
- Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Laboratory Animals. 54 (3), 213-224 (2020).
