Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

Summary

Hier beschrijven we een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om met succes in vitro fotodynamische therapie (PDT) -testen uit te voeren met behulp van tweedimensionale HeLa-celcultuur en verteporfine als een fotosensitizer.

Abstract

Dit artikel beschrijft een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om in vitro fotodynamische therapie (PDT) assays uit te voeren, genaamd de PhotoACT. Het apparaat is gebouwd met behulp van een set conventionele programmeerbare lichtgevende diodes (LED’s), een LCD-module (Liquid Crystal Display) en een lichtsensor die is aangesloten op een commercieel microcontrollerbord. De doosgebaseerde structuur van het prototype is gemaakt met vezelplaten met gemiddelde dichtheid (MDF’s). Het interne compartiment kan tegelijkertijd vier celkweek multiwell microplaten toewijzen.

Als proof of concept bestudeerden we het cytotoxische effect van de photosensitizer (PS) verteporfine tegen de HeLa cellijn in tweedimensionale (2D) cultuur. HeLa-cellen werden behandeld met toenemende concentraties verteporfine gedurende 24 uur. Het geneesmiddelbevattende supernatantmedium werd weggegooid, de aanhangende cellen werden gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en medicijnvrij medium werd toegevoegd. In deze studie werd het effect van verteporfine op cellen onderzocht zonder blootstelling aan licht of na blootstelling gedurende 1 uur aan licht met behulp van rood-groen-blauwe (RGB) waarden van 255, 255 en 255 (gemiddelde fluence van 49,1 ± 0,6 J / cm²). Na 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cel beoordeeld met de 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test.

Experimentele resultaten toonden aan dat blootstelling van cellen behandeld met verteporfine aan het licht van het apparaat het cytotoxische effect van het medicijn verbetert via een mechanisme gemedieerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS). Bovendien werd het gebruik van het prototype dat in dit werk wordt beschreven gevalideerd door de resultaten te vergelijken met een commercieel PDT-apparaat. Dit op LED gebaseerde prototype van fotodynamische therapie is dus een goed alternatief voor in vitro studies van PDT.

Introduction

Onder de meest dodelijke niet-overdraagbare ziekten vertegenwoordigt kanker een wereldwijd toonaangevende oorzaak van vroegtijdig overlijden. Het was goed voor bijna 10 miljoen sterfgevallen in 2020, wat neerkomt op ongeveer een op de zes sterfgevallen wereldwijd¹. Bovendien vormt het fenomeen multidrugresistentie (MDR) een enorme bedreiging voor de volksgezondheid, omdat goedgekeurde chemotherapeutische protocollen de remissiestadia voor deze klinische aandoening niet bereiken². Kankercellen kunnen resistentie tegen chemotherapie ontwikkelen via verschillende mechanismen; de overexpressie van sommige ATP-binding cassette (ABC) transporters – ATP-afhankelijke effluxpompen – wordt echter beschouwd als de belangrijkste oorzaak van MDR-ontwikkeling binnen een tumormicro-omgeving³. Naast MDR versterken andere kankercomplicaties, zoals recidief en metastase, de dringende vraag om therapeutische benaderingen te ontwikkelen en te verbeteren om deze oncologische uitdaging te overwinnen.

Het curatieve gebruik van licht wordt al eeuwenlang beoefend⁴, en fotodynamische therapie (PDT) vertegenwoordigt een klinisch goedgekeurde therapeutische benadering voor solide tumoren. PDT combineert de toediening van een fotosensitizer (PS) gevolgd door lichte bestraling om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren om selectieve cytotoxiciteit in tumorcellen uit te oefenen. Deze therapeutische benadering is superieur aan conventionele methoden, waaronder chirurgie, bestraling en chemotherapie⁵; het is een minimaal invasieve techniek die een lagere cytotoxiciteit in bindweefsels laat zien⁶. De lichte toepassing en PS-accumulatie direct in de tumor of zijn micro-omgeving zorgen voor nauwkeurige targeting en bijgevolg kleine, ongewenste systemische bijwerkingen⁷ en de mogelijkheid van herhaalde behandeling op dezelfde plaats. Bovendien zijn de kosten lager dan die van andere benaderingen. Vanwege de veelbelovende kenmerken kan PDT worden beschouwd als een geschikte optie voor zowel enkelvoudige, vooral in het geval van inoperabele tumoren, als adjuvante kankerbehandeling⁷, en vertegenwoordigt het een alternatief voor MDR gerelateerd aan chemotherapie ^8,9.

Het eerste rapport met een hoge objectieve respons met PDT werd in 1975 beschreven in een muis en rat model¹⁰. Sindsdien zijn studies uitgevoerd met PDT met positieve uitkomsten⁷ zowel in vivo als in vitro met menselijke tumorcellijnen in 2D-celcultuur^11,12. Gezien de brede toepasbaarheid van klinisch goedgekeurde PS, ongeacht hun specifieke accumulatieroutes en golflengtebereiken van absorptiepieken, is het algemene proces als volgt: (i) PS-opname, (ii) pieken van PS-concentratie bij de tumor of zijn micro-omgeving, (iii) lichttoepassing, (iv) PS-lichtinteractie, (v) overdracht van PS-opgewekte energie naar weefselsubstraat of omringende zuurstofmoleculen, (vi) ROS-productie met singletzuurstof- of superoxide-anion, vii) tumorceldood via, in wezen, necrose of apoptose (directe dood), autofagie (cytoprotectief mechanisme), weefselischemie (vasculaire schade), immuunmodulatie of een overlapping van deze mechanismen⁷. In deze laatste fase hangt de activering van een specifieke celdoodroute af van vele factoren, zoals celkenmerken, experimenteel ontwerp en, belangrijker nog, PS intracellulaire lokalisatie en PDT-gerelateerde gerichte schade¹³.

Verteporfine is een ps van de tweede generatie, goedgekeurd door regelgevende instanties voor klinisch gebruik in Noorwegen en China voor de behandeling van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie⁷. Na toediening van de dosis werd gemeld dat dit prodrug zich gedeeltelijk ophoopte in mitochondriën¹⁴ en cellulaire eiwit tyrosinefosforylering en DNA-fragmentatie induceerde, wat leidde tot tumorcelapoptose ^15,16. Na 24 uur incubatie voor verteporfine internalisatie, wordt een PDT-protocol met behulp van een 690 nm golflengte-opstelling aanbevolen om effectieve niveaus van elektromagnetische stralingsoverdracht naar aangrenzende moleculen te bereiken ^7,17.

Wat de lichtbron voor PDT betreft, zijn de klassieke diodelasersystemen meestal duur, technisch ingewikkeld, oversized en dus niet overdraagbaar^18,19. Als gevolg van het profiel met één golflengte, dat ook kan worden waargenomen in LED-gebaseerde PDT-apparatuur, maakt de vraag naar onafhankelijke eenheden voor elke fotosensitizertoepassing het gebruik van diodelasersystemen nog complexer en economisch onhaalbaar^20,21. Daarom wordt het gebruik van LED-machines beschouwd als het meest veelbelovende alternatief om niet alleen kosten²² en onderhoudsproblemen op te lossen, maar ook om een hoog vermogen en minder schadelijk²³ en een breder verlichtingsvermogen^{te bieden 24,25,26,27}.

Ondanks de potentiële bijdrage die LED-gebaseerde apparatuur kan bieden aan PDT-experimenten²⁸, hebben de meeste commerciële opties nog steeds nadelen, zoals een gebrek aan draagbaarheid, hoge kosten en complexe bouwprojecten en exploitatie²⁹. Het belangrijkste doel van dit werk was om een eenvoudig en betrouwbaar hulpmiddel te bieden voor in vitro PDT-testen. Dit artikel beschrijft PhotoACT, een in eigen huis gebouwd LED-gebaseerd PDT-apparaat, dat goedkoop, gebruiksvriendelijk en draagbaar is. Als proof of concept is aangetoond dat dit apparaat de cytotoxiciteit van verteporfine in een 2D-celkweekmodel verbetert en daarom kan het worden gebruikt als een onderzoeksinstrument in PDT-experimenten.

Protocol

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, reagentia en software die in dit protocol worden gebruikt. 1. Constructie van het apparaat Zaag 3 mm dikke vezelplaten met gemiddelde dichtheid (MDF) om stukken te verkrijgen met de afmetingen die zijn aangegeven in figuur 1A.OPMERKING: Gebruik het vectorbestand (aanvullend bestand 1) voor CNC-snijden (computer numerica…

Representative Results

Het laatste PDT-apparaat, genaamd de PhotoACT, bevatte een donkere kamer om maximaal vier multiwell-microplaten toe te wijzen, waarbij het bovenste binnenoppervlak was uitgerust met een set van 30 verspreide LED’s die waren geprogrammeerd om verschillende spectrums van zichtbaar licht uit te zenden (figuur 3 en aanvullend bestand 6). Het apparaat is gebouwd met behulp van twee bijbehorende dozen: een interne doos die is ontworpen als een donkere kamer voor de PDT-testen en e…

Discussion

Het uiteindelijke PhotoACT-apparaat was handig om te bouwen met commercieel verkrijgbare, goedkope componenten voor een totale kostprijs van minder dan $ 50. Bijkomende voordelen zijn onder meer lage onderhoudsvereisten, de capaciteit om meerdere soorten kweekplaten te bestralen, het gelijktijdige gebruik van maximaal vier eenheden per test, een laag gewicht (2 kg) / grootte (44 cm³) dat draagbaarheid, nauwkeurige en reproduceerbare bestraling mogelijk maakt (gegevens niet weergegeven) en een gebruiksvriendeli…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)