Собственное устройство фотодинамической терапии на основе светодиодов для повышения цитотоксичности вертепорфина в 2D-модели клеточной культуры

Summary

Здесь мы описываем новое, простое и недорогое устройство для успешного выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT) с использованием двумерной культуры клеток HeLa и вертепорфина в качестве фотосенсибилизатора.

Abstract

В этой статье описывается новое, простое и недорогое устройство для выполнения анализов фотодинамической терапии in vitro (PDT), названное PhotoACT. Устройство было построено с использованием набора обычных программируемых светодиодов (LED), модуля жидкокристаллического дисплея (LCD) и датчика освещенности, подключенного к плате коммерческого микроконтроллера. Коробчатая конструкция прототипа была выполнена из древесноволокнистых плит средней плотности (MDF). Внутренний отсек может одновременно выделять четыре многоязычные микропластины клеточной культуры.

В качестве доказательства концепции мы изучили цитотоксический эффект фотосенсибилизатора (PS) вертепорфина против клеточной линии HeLa в двумерной (2D) культуре. Клетки HeLa обрабатывали повышением концентрации вертепорфина в течение 24 ч. Лекарственно-содержащую надпосадочную среду выбрасывали, адгезивные клетки промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и добавляли безмедикаментозную среду. В этом исследовании влияние вертепорфина на клетки изучали либо без воздействия света, либо после воздействия света в течение 1 ч с использованием красно-зелено-синих (RGB) значений 255, 255 и 255 (средняя плавность 49,1 ± 0,6 Дж/^см2). Через 24 ч жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).

Экспериментальные результаты показали, что воздействие на клетки, обработанные вертепорфином, на свет от устройства усиливает цитотоксический эффект препарата через механизм, опосредованный активными формами кислорода (АФК). Кроме того, использование прототипа, описанного в этой работе, было подтверждено путем сравнения результатов с коммерческим устройством PDT. Таким образом, этот прототип фотодинамической терапии на основе светодиодов представляет собой хорошую альтернативу для исследований ФДТ in vitro .

Introduction

Среди наиболее смертоносных неинфекционных заболеваний рак представляет собой ведущую глобальную причину преждевременной смерти. На его долю пришлось почти 10 миллионов смертей в 2020 году, что составляет примерно одну из шести смертей во всем мире¹. Кроме того, явление множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) представляет собой огромную угрозу для общественного здравоохранения, поскольку утвержденные химиотерапевтические протоколы не достигают стадий ремиссии для этого клинического состояния². Раковые клетки могут развивать устойчивость к химиотерапии через несколько механизмов; однако сверхэкспрессия некоторых АТФ-связывающих кассетных (АВС) транспортеров – АТФ-зависимых эффлюксных насосов – считается основной причиной развития МЛУ в микроокружении опухоли³. В дополнение к MDR, другие осложнения рака, такие как рецидив и метастазирование, усиливают настоятельную потребность в разработке и совершенствовании терапевтических подходов для преодоления этой онкологической проблемы.

Лечебное использование света практикуется на протяжении^{веков 4}, и фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой клинически одобренный терапевтический подход для солидных опухолей. ФДТ сочетает в себе введение фотосенсибилизатора (PS) с последующим световым облучением для генерации активных форм кислорода (АФК) для оказания селективной цитотоксичности в опухолевых клетках. Этот терапевтический подход превосходит обычные методы, включая хирургию, облучение и химиотерапию⁵; это минимально инвазивный метод, показывающий более низкую цитотоксичность в соединительных тканях⁶. Легкое применение и накопление PS непосредственно в опухоли или ее микросреде обеспечивают точное нацеливание и, следовательно, незначительные, нежелательные системные побочные эффекты⁷ и возможность повторного лечения на том же участке. Более того, стоимость ниже, чем у других подходов. Благодаря своим многообещающим особенностям ФДТ можно считать подходящим вариантом как для единичных, особенно в случае неоперабельных опухолей, так и для адъювантного лечения рака⁷, и представляет собой альтернативу МЛУ, связанной с химиотерапией ^8,9.

Первый отчет, показывающий высокую объективную частоту ответа с использованием PDT, был описан в 1975 году на мышиной и крысиной модели¹⁰. С тех пор исследования проводились с использованием ФДТ с положительными исходами⁷ как in vivo, так и in vitro с линиями опухолевых клеток человека в 2D клеточной культуре^11,12. Учитывая широкую применимость клинически одобренных PS, независимо от их специфических путей накопления и диапазонов длин волн пиков поглощения, общий процесс выглядит следующим образом: (i) поглощение PS, (ii) достижение пика концентрации PS в опухоли или ее микроокружении, (iii) применение света, (iv) взаимодействие PS-света, (v) передача энергии возбужденного состояния PS либо тканевому субстрату, либо окружающим молекулам кислорода, (vi) Производство АФК с участием синглетного кислорода или супероксидного аниона, (vii) гибель опухолевых клеток посредством, по существу, некроза или апоптоза (прямая смерть), аутофагии (цитопротекторный механизм), ишемии тканей (повреждение сосудов), иммунной модуляции или перекрытия этих механизмов⁷. На этом заключительном этапе активация конкретного пути гибели клеток зависит от многих факторов, таких как характеристики клеток, экспериментальный дизайн и, самое главное, внутриклеточная локализация PS и целенаправленное повреждение, связанное с ФДТ¹³.

Вертепорфин является PS второго поколения, одобренным регулирующими органами для клинического использования в Норвегии и Китае для лечения возрастной макулярной дегенерации⁷. Сообщалось, что после доставки дозы этот пролекарство частично накапливается в митохондриях¹⁴ и индуцирует фосфорилирование тирозина клеточного белка и фрагментацию ДНК, что приводит к апоптозу опухолевых клеток ^15,16. После 24-часовой инкубации для интернализации вертепорфинов рекомендуется протокол PDT с использованием установки длины волны 690 нм для достижения эффективных уровней передачи электромагнитного излучения соседним молекулам ^7,17.

Что касается источника света для PDT, классические диодные лазерные системы обычно дорогие, технически сложные, негабаритные и, следовательно, непортируемые^18,19. Как следствие его одноволнового профиля, который также можно наблюдать в оборудовании PDT на основе светодиодов, потребность в независимых блоках для каждого применения фотосенсибилизатора делает использование диодных лазерных систем еще более сложным и экономически нецелесообразным^20,21. Поэтому использование светодиодной техники считается наиболее перспективной альтернативой для решения не только затрат²² и вопросов технического обслуживания, но и для обеспечения высокой выходной мощности и менее вредной²³ и более широкой осветительной способности 24,25,26,27.

Несмотря на потенциальный вклад, который светодиодное оборудование может предложить в эксперименты PDT²⁸, большинство коммерческих вариантов по-прежнему имеют недостатки, такие как отсутствие портативности, высокая стоимость и сложные строительные проекты и эксплуатация²⁹. Основная цель этой работы заключалась в том, чтобы предложить простой и надежный инструмент для анализа PDT in vitro . В этой статье описывается PhotoACT, собственное устройство PDT на основе светодиодов, которое является недорогим, удобным для пользователя и портативным. В качестве доказательства концепции показано, что это устройство усиливает цитотоксичность вертепорфина в модели 2D-культуры клеток и, следовательно, может быть использовано в качестве исследовательского инструмента в экспериментах PDT.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации , относящейся ко всем материалам, реагентам и программному обеспечению, используемым в этом протоколе. 1. Конструкция устройства Пила пилой древесноволокнистых плит средней пл?…

Representative Results

Последнее устройство PDT, названное PhotoACT, включало темную камеру для выделения до четырех многолуночных микропластин, а его верхняя внутренняя поверхность была оснащена набором из 30 рассеянных светодиодов, запрограммированных на испускание различных спектров видимого света (<strong class="xf…

Discussion

Окончательное устройство PhotoACT было удобно строить с коммерчески доступными недорогими компонентами общей стоимостью менее 50 долларов. Дополнительные преимущества включают в себя низкие требования к техническому обслуживанию, способность облучать несколько типов культуральных пла?…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)