2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치
Summary
여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.
Abstract
이 백서에서는 PhotoACT라는 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 수행하기 위한 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다. 이 장치는 기존의 프로그래밍 가능 발광 다이오드(LED), 액정 디스플레이(LCD) 모듈 및 상용 마이크로 컨트롤러 기판에 연결된 광 센서 세트를 사용하여 제작되었습니다. 프로토 타입의 박스 기반 구조는 중간 밀도 섬유판 (MDF)으로 만들어졌습니다. 내부 구획은 4개의 세포 배양 멀티웰 마이크로플레이트를 동시에 할당할 수 있습니다.
개념 증명으로 2차원(2D) 배양에서 HeLa 세포주에 대한 광민감제(PS) 베르테포르핀의 세포독성 효과를 연구했습니다. HeLa 세포를 24 시간 동안 증가하는 농도의 베르테 포르핀으로 처리했습니다. 약물-함유 상청액 배지를 버리고, 부착성 세포를 인산완충식염수(PBS)로 세척하고, 약물-없는 배지를 첨가하였다. 이 연구에서, 세포에 대한 베르테 포르 핀의 효과는 255, 255 및 255의 적색-녹색-청색 (RGB) 값 (평균 플루언스 49.1 ± 0.6 J / cm2)을 사용하여 빛에 노출되지 않거나 1 시간 동안 노출된 후 조사되었습니다. 24시간 후, 세포 생존율을 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석에 의해 평가하였다.
실험 결과는 베르테 포르 핀으로 처리 된 세포를 장치의 빛에 노출시키는 것이 활성 산소 종 (ROS)에 의해 매개되는 메커니즘을 통해 약물의 세포 독성 효과를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 또한이 작업에 설명 된 프로토 타입의 사용은 결과를 상용 PDT 장치와 비교하여 검증되었습니다. 따라서이 LED 기반 광 역학 치료 프로토 타입은 PDT의 체외 연구를위한 좋은 대안을 나타냅니다.
Introduction
가장 치명적인 비전염성 질병 중 암은 조기 사망의 세계적인 주요 원인입니다. 2020년에는 거의 1,000만 명이 사망했으며, 이는 전 세계적으로 사망자 6명 중 1명에 해당합니다1. 또한 다제 내성(MDR) 현상은 승인된 화학 요법 프로토콜이 이임상 상태에 대한 완화 단계에 도달하지 못하기 때문에 엄청난 공중 보건 위협을 나타냅니다2. 암세포는 여러 메커니즘을 통해 화학 요법에 대한 내성을 개발할 수 있습니다. 그러나, 일부 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체(ATP-의존성 유출 펌프)의 과발현은 종양 미세환경 내에서 MDR 발달의 주요 원인으로 간주된다3. MDR 외에도 재발 및 전이와 같은 다른 암 합병증은 이러한 종양학적 문제를 극복하기 위한 치료 접근법을 개발하고 개선해야 하는 긴급한 요구를 강화합니다.
빛의 치료 적 활용은 수세기 동안 실행되어 왔으며 4 광역학 요법 (PDT)은 고형 종양에 대해 임상 적으로 승인 된 치료 접근법을 나타냅니다. PDT는 광감작제(PS) 투여 후 광 조사를 결합하여 활성 산소 종(ROS)을 생성하여 종양 세포에서 선택적 세포 독성을 발휘합니다. 이 치료 접근법은 수술, 방사선 및 화학 요법을 포함한 기존의 방법보다 우수합니다5; 결합 조직에서 더 낮은 세포 독성을 나타내는 최소 침습적 기술입니다6. 종양 또는 그 미세 환경에 직접 가벼운 적용과 PS 축적은 정확한 표적화를 보장하고, 결과적으로 경미하고 바람직하지 않은 전신 부작용7 및 동일한 부위에서의 반복 치료 가능성을 보장합니다. 또한 비용은 다른 접근 방식보다 저렴합니다. 그의 유망한 특징으로 인해, PDT는 단일, 특히 수술불가능한 종양의 경우 또는 보조 암 치료7 모두에 적합한 옵션으로 간주될 수 있으며, 화학요법 8,9와 관련된 MDR에 대한 대안을 나타낸다.
PDT를 사용하여 높은 객관적 반응률을 보여주는 첫 번째 보고서는 1975 년 마우스 및 래트 모델10에서 설명되었습니다. 그 이후로, 2D 세포 배양11,12에서 인간 종양 세포주와 함께 생체 내 및 시험관 내 모두에서 긍정적 인 결과7를 가진 PDT를 사용하여 연구가 수행되었습니다. 임상 적으로 승인 된 PS의 광범위한 적용 가능성을 고려할 때, 특정 축적 경로 및 흡수 피크의 파장 범위에 관계없이 일반적인 프로세스는 다음과 같습니다 : (i) PS 흡수, (ii) 종양 또는 미세 환경에서 PS 농도의 피크, (iii) 광 적용, (iv) PS- 광 상호 작용, (v) PS 여기 상태 에너지를 조직 기질 또는 주변 산소 분자로 전달, (vi) 일중항 산소 또는 슈퍼옥사이드 음이온을 수반하는 ROS 생산, (vii) 본질적으로 괴사 또는 세포자멸사멸(직접 사망), 자가포식(세포 보호 메커니즘), 조직 허혈(혈관 손상), 면역 조절 또는 이러한 메커니즘의 중첩을 통한 종양 세포 사멸7. 이 마지막 단계에서, 특정 세포 사멸 경로의 활성화는 세포 특성, 실험 설계 및 가장 중요하게는 PS 세포 내 국소화 및 PDT 관련 표적 손상과 같은 많은 인자에 의존한다13.
Verteporfin은 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위해 노르웨이와 중국에서 임상 사용을 위해 규제 기관의 승인을 받은 2세대 PS입니다7. 용량 전달 후, 이 전구약물은 미토콘드리아14에 부분적으로 축적되고 세포 단백질 티로신 인산화 및 DNA 단편화를 유도하여 종양 세포 세포사멸15,16을 유도하는 것으로 보고되었습니다. 베르테포르핀 내재화를 위한 24시간 배양 후, 인접한 분자 7,17로의 전자기 방사선 전달의 효과적인 수준을 달성하기 위해 690nm 파장 셋업을 사용하는 PDT 프로토콜이 권장됩니다.
PDT의 광원과 관련하여 클래식 다이오드 레이저 시스템은 일반적으로 비싸고 기술적으로 복잡하며 크기가 커서 휴대 할 수 없습니다18,19. LED 기반 PDT 장비에서도 관찰할 수 있는 단일 파장 프로파일의 결과로 각 감광제 응용 분야에 대한 독립적인 장치에 대한 요구로 인해 다이오드 레이저 시스템의 활용이 훨씬 더 복잡하고 경제적으로 실현 불가능해집니다20,21. 따라서 LED 기계의 활용은 비용(22) 및 유지 보수 문제뿐만 아니라 높은 전력 출력과 덜 유해한 23 및 더 넓은 조명 기능(24,25,26,27)을 제공하는 가장 유망한 대안으로 간주됩니다.
LED 기반 장비가 PDT 실험(28)에 제공할 수 있는 잠재적인 기여에도 불구하고, 대부분의 상업적 옵션은 여전히 휴대성 부족, 높은 비용, 및 복잡한 건설 프로젝트 및 운영(29)과 같은 단점을 가지고 있다. 이 연구의 주요 목적은 체외 PDT 분석을 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하는 것이었습니다. 이 백서에서는 저렴하고 사용자 친화적이며 휴대가 가능한 자체 내장 LED 기반 PDT 장치인 PhotoACT에 대해 설명합니다. 개념 증명으로이 장치는 2D 세포 배양 모델에서 베르테 포르 핀의 세포 독성을 향상시키는 것으로 나타 났으므로 PDT 실험에서 연구 도구로 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최종 PhotoACT 장치는 총 50달러 미만의 비용으로 상업적으로 이용 가능한 저렴한 구성 요소로 구성하기에 편리했습니다. 추가적인 장점으로는 낮은 유지보수 요구, 여러 유형의 배양 플레이트를 조사할 수 있는 용량, 분석당 최대 4개의 장치를 동시에 사용할 수 있는 경량(2kg)/크기(44cm3), 휴대성, 정확하고 재현 가능한 조사(데이터는 표시되지 않음), 컴퓨터 또는 다른 기계에 연결할 필요가 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
촬영 과정을 도와준 Arthur Henrique Gomes de Oliveira와 Lucas Julian Cruz Gomes에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 브라질 연구 위원회(CNPq, 보조금 번호 400953/2016-1-404286/2021-6) 및 Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001에 의해 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
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