2 डी सेल कल्चर मॉडल में वर्टेपोरफिन साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाने के लिए एक इन-हाउस-बिल्ट और लाइट-एमिटिंग-डायोड-आधारित फोटोडायनामिक थेरेपी डिवाइस
Summary
यहां, हम एक फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में दो-आयामी हेला सेल संस्कृति और वर्टेपोरफिन का उपयोग करके इन विट्रो फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) परख को सफलतापूर्वक करने के लिए एक उपन्यास, सरल और कम लागत वाले उपकरण का वर्णन करते हैं।
Abstract
यह पेपर इन विट्रो फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) परख करने के लिए एक उपन्यास, सरल और कम लागत वाले उपकरण का वर्णन करता है, जिसका नाम फोटोएसीटी है। डिवाइस को पारंपरिक प्रोग्राम करने योग्य प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी), एक तरल क्रिस्टल डिस्प्ले (एलसीडी) मॉड्यूल और एक वाणिज्यिक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड से जुड़े एक प्रकाश सेंसर के एक सेट का उपयोग करके बनाया गया था। प्रोटोटाइप की बॉक्स-आधारित संरचना मध्यम घनत्व फाइबरबोर्ड (एमडीएफ) के साथ बनाई गई थी। आंतरिक डिब्बे एक साथ चार सेल कल्चर मल्टीवेल माइक्रोप्लेट आवंटित कर सकते हैं।
अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने दो आयामी (2 डी) संस्कृति में हेला सेल लाइन के खिलाफ फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) वर्टेपोरफिन के साइटोटोक्सिक प्रभाव का अध्ययन किया। हेला कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए वर्टेपोरफिन की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज किया गया था। दवा युक्त सुपरनैटेंट माध्यम को छोड़ दिया गया था, अनुयायी कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धोया गया था, और दवा-मुक्त माध्यम जोड़ा गया था। इस अध्ययन में, कोशिकाओं पर वर्टेपोरफिन के प्रभाव की जांच या तो प्रकाश जोखिम के बिना या 255, 255 और 255 के लाल-हरे-नीले (आरजीबी) मूल्यों का उपयोग करके प्रकाश के लिए 1 घंटे के संपर्क के बाद की गई थी (49.1 ± 0.6 जे / सेमी2 की औसत समृद्धि)। 24 घंटे के बाद, सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन 3-(4,5-डाइमिथाइल-2-थियाज़ोलिल)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख द्वारा किया गया था।
प्रायोगिक परिणामों से पता चला है कि डिवाइस से प्रकाश के लिए वर्टेपोरफिन के साथ इलाज की गई कोशिकाओं के संपर्क में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा मध्यस्थ तंत्र के माध्यम से दवा के साइटोटोक्सिक प्रभाव को बढ़ाता है। इसके अलावा, इस काम में वर्णित प्रोटोटाइप का उपयोग एक वाणिज्यिक पीडीटी डिवाइस के साथ परिणामों की तुलना करके मान्य किया गया था। इस प्रकार, यह एलईडी-आधारित फोटोडायनामिक थेरेपी प्रोटोटाइप पीडीटी के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक अच्छा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।
Introduction
सबसे घातक गैर-संचारी रोगों में से, कैंसर समय से पहले मृत्यु का एक वैश्विक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है। यह 2020 में लगभग 10 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार था, जो दुनिया भर में छह मौतों में से लगभग एक का प्रतिनिधित्व करताहै। इसके अतिरिक्त, मल्टीड्रग प्रतिरोध (एमडीआर) घटना एक जबरदस्त सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरे का प्रतिनिधित्व करती है, क्योंकि अनुमोदित कीमोथेरेपी प्रोटोकॉल इस नैदानिक स्थिति 2 के लिए छूट चरणों तक पहुंचने में विफलरहते हैं। कैंसर कोशिकाएं कई तंत्रों के माध्यम से कीमोथेरेपी के लिए प्रतिरोध विकसित कर सकती हैं; हालांकि, कुछ एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स – एटीपी-निर्भर एफ्लक्स पंप – के ओवरएक्प्रेशन को ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट3 के भीतर एमडीआर विकास का मुख्य कारण माना जाता है। एमडीआर के अलावा, अन्य कैंसर जटिलताओं, जैसे पुनरावृत्ति और मेटास्टेसिस, इस ऑन्कोलॉजिकल चुनौती को दूर करने के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने और सुधारने की तत्काल मांग को मजबूत करते हैं।
प्रकाश के उपचारात्मक उपयोग का अभ्यास सदियोंसे किया गया है, और फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) ठोस ट्यूमर के लिए नैदानिक रूप से अनुमोदित चिकित्सीय दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करती है। पीडीटी ट्यूमर कोशिकाओं में चयनात्मक साइटोटॉक्सिसिटी को लागू करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पन्न करने के लिए प्रकाश विकिरण के बाद एक फोटोसेंसिटाइज़र (पीएस) के प्रशासन को जोड़ती है। यह चिकित्सीय दृष्टिकोण सर्जरी, विकिरणऔर कीमोथेरेपी सहित पारंपरिक तरीकों से बेहतर है; यह एक न्यूनतम इनवेसिव तकनीक है जो संयोजी ऊतकों में कम साइटोटॉक्सिसिटी दिखातीहै। ट्यूमर या इसके माइक्रोएन्वायरमेंट में सीधे प्रकाश अनुप्रयोग और पीएस संचय सटीक लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करते हैं और परिणामस्वरूप, मामूली, अवांछनीय प्रणालीगत दुष्प्रभाव7 और एक ही साइट पर बार-बार उपचार की संभावना होती है। इसके अलावा, लागत अन्य दृष्टिकोणों की तुलना में कम है। इसकी आशाजनक विशेषताओं के कारण, पीडीटी को एकल दोनों के लिए एक उपयुक्त विकल्प माना जा सकता है, विशेष रूप से निष्क्रिय ट्यूमर, या सहायक कैंसर उपचार7 के मामले में, और कीमोथेरेपी 8,9 से संबंधित एमडीआर के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।
पीडीटी का उपयोग करके उच्च उद्देश्य प्रतिक्रिया दर दिखाने वाली पहली रिपोर्ट 1975 में माउस और चूहे मॉडल10 में वर्णित की गई थी। तब से, 2 डी सेल कल्चर11,12 में मानव ट्यूमर सेललाइनों के साथ विवो और इन विट्रो दोनों में सकारात्मक परिणामों के साथ पीडीटी का उपयोग करके अध्ययन किए गए हैं। नैदानिक रूप से अनुमोदित पीएस की व्यापक प्रयोज्यता को ध्यान में रखते हुए, उनके विशिष्ट संचय मार्गों और अवशोषण चोटियों की तरंग दैर्ध्य सीमाओं की परवाह किए बिना, सामान्य प्रक्रिया निम्नानुसार है: (i) पीएस अपटेक, (ii) ट्यूमर या उसके माइक्रोएन्वायरमेंट में पीएस एकाग्रता का चरम, (iii) प्रकाश अनुप्रयोग, (iv) पीएस-लाइट इंटरैक्शन, (वी) पीएस उत्तेजित-अवस्था ऊर्जा का ऊतक सब्सट्रेट या आसपास के ऑक्सीजन अणुओं में स्थानांतरण, (vi) आरओएस उत्पादन जिसमें एकल ऑक्सीजन या सुपरऑक्साइड आयन शामिलहैं, (vii) अनिवार्य रूप से, नेक्रोसिस या एपोप्टोसिस (प्रत्यक्ष मृत्यु), ऑटोफैगी (साइटोप्रोटेक्टिव तंत्र), ऊतक इस्किमिया (संवहनी क्षति), प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन, या इन तंत्रों के ओवरलैप के माध्यम से ट्यूमर कोशिका मृत्यु। इस अंतिम चरण में, एक विशिष्ट कोशिका मृत्यु मार्ग का सक्रियण कई कारकों पर निर्भर करता है, जैसे सेल विशेषताओं, प्रयोगात्मक डिजाइन और, सबसे महत्वपूर्ण बात, पीएस इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण और पीडीटी से संबंधित लक्षित क्षति13।
वर्टेपोरफिन एक दूसरी पीढ़ी का पीएस है, जिसे नॉर्वे और चीन में नैदानिक उपयोग के लिए नियामक एजेंसियों द्वारा उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन 7 के इलाज के लिए अनुमोदितकिया गया है। खुराक वितरण के बाद, इस प्रोड्रग को आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया14 में जमा होने और सेलुलर प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फोराइलेशन और डीएनए विखंडन को प्रेरित करने की सूचना मिली, जिससे ट्यूमर सेल एपोप्टोसिस15,16 हो गया। वर्टेपोरफिन आंतरिककरण के लिए 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, 690 एनएम तरंगदैर्ध्य सेटअप का उपयोग करके एक पीडीटी प्रोटोकॉल को आसन्न अणुओं7,17 में विद्युत चुम्बकीय विकिरण हस्तांतरण के प्रभावी स्तर को प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है।
पीडीटी के लिए प्रकाश स्रोत के बारे में, शास्त्रीय डायोड लेजर सिस्टम आमतौर पर महंगे, तकनीकी रूप से जटिल, ओवरसाइज़्ड होते हैं, और इस प्रकार18,19। इसकी एकल-तरंग दैर्ध्य प्रोफ़ाइल के परिणामस्वरूप, जिसे एलईडी-आधारित पीडीटी उपकरणों में भी देखा जा सकता है, प्रत्येक फोटोसेंसिटाइज़र एप्लिकेशन के लिए स्वतंत्र इकाइयों की मांग डायोड लेजर सिस्टम के उपयोग को और भी जटिल और आर्थिक रूपसे अव्यावहारिक बनाती है। इसलिए, एलईडी मशीनरी के उपयोग को न केवल लागतऔर रखरखाव के मुद्दों को हल करने के लिए सबसे आशाजनक विकल्प माना जाता है, बल्कि उच्च शक्ति उत्पादन और कम हानिकारक23 और व्यापक रोशन क्षमता 24,25,26,27 प्रदान करने के लिए भी माना जाता है।
संभावित योगदान के बावजूद जो एलईडी-आधारित उपकरण पीडीटी प्रयोगों28 को पेश कर सकते हैं, अधिकांश वाणिज्यिक विकल्पों में अभी भी पोर्टेबिलिटी की कमी, उच्च लागत और जटिल निर्माण परियोजनाओं और संचालन29 जैसी कमियां हैं। इस काम का मुख्य उद्देश्य इन विट्रो पीडीटी परख के लिए एक सरल और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करना था। यह पेपर फोटोएसीटी का वर्णन करता है, जो एक इन-हाउस-निर्मित एलईडी-आधारित पीडीटी डिवाइस है, जो सस्ती, उपयोगकर्ता के अनुकूल और पोर्टेबल है। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, इस उपकरण को 2 डी सेल कल्चर मॉडल में वर्टेपोरफिन की साइटोटॉक्सिसिटी को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है और इसलिए, पीडीटी प्रयोगों में एक शोध उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अंतिम फोटोएसीटी डिवाइस $ 50 से कम की कुल लागत पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, कम लागत वाले घटकों के साथ निर्माण करने के लिए सुविधाजनक था। अतिरिक्त लाभों में कम रखरखाव की मांग, कई प्रकार की संस्कृति प्लेटों क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आर्थर हेनरिक गोम्स डी ओलिवेरा और लुकास जूलियन क्रूज़ गोम्स को फिल्मांकन प्रक्रिया में मदद करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस परियोजना को ब्राजील के अनुसंधान परिषद (सीएनपीक्यू, अनुदान संख्या 400953/2016-1-404286/2021-6) और फंडाको अरौकारिया-पीपीएसयूएस 2020/2021 (एसयूएस 2020131000003) द्वारा समर्थित किया गया था। इस अध्ययन को कूर्डेनाको डी एपर्फीकोआमेंटो डी पेस्सोअल डी निवेल सुपीरियर-ब्रासिल (सीएपीएस)-वित्त कोड 001 द्वारा भी वित्तपोषित किया गया था।
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what’s past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two – cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- . T. SketchUp Available from: https://www.sketchup.com/ (2022)
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022)
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022)
